贵州省烟草赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性基线

雷飞斌, 汪汉成, 代园凤, 张传清*,

(1. 浙江农林大学 农业与食品科学学院，杭州 311300；2. 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；3. 贵州省烟草公司毕节市公司，贵州 毕节 551700)

贵州属于优质烟草种植区，常年种植烟草13万公顷左右，是中国烟叶产量第二大省份。烟草赤星病 (brown spot) 是危害烟草叶部最严重的病害之一，在世界各产区均有发生[1]。赤星病的病原菌为链格孢属真菌，地区间有一定差异。据报道，云南的烟草赤星病病原菌为交链格孢Alternaria alternata和长柄链格孢A. longipes，而河南的为链格孢A. alternata、长柄链格孢A. longipes和鸭梨链格孢A. yaliinficiens[2]。

目前，生产上烟草赤星病以化学防治为主，其中苯并咪唑类杀菌剂和二甲酰亚胺类杀菌剂被广泛应用，导致贵州等地已有关于链格孢A.alternata出现抗药性情况的报道[3-4]，急需引入新型药剂用于其抗性治理和病害防治。以啶酰菌胺(boscalid) 为代表的琥珀酸脱氢酶抑制剂 (SDHIs)对链格孢属和葡萄孢属真菌具有较高的生物活性，近年来已被广泛用于由多种链格孢菌引起的植物病害的防治[5-6]。鉴于此，本研究对贵州省烟草赤星病病原菌进行了分离，综合形态学特征及分子鉴定结果对其进行了系统鉴定，同时建立了贵州省烟草赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性基线，以期为啶酰菌胺在烟草赤星病防治上的推广应用及后续监测其敏感性变化提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

95%啶酰菌胺 (boscalid) 原药，浙江新农化工股份有限公司提供，用丙酮配制成40 mg/mL的母液，4 ℃下保存。

1.2 菌株的采集与分离

于2014—2015年从贵州省福泉和兴义等地田间随机采集烟草赤星病病样，每个采样点在采样前均未曾使用过SDHIs类杀菌剂。通过常规组织分离，每个采样点保留5株左右病菌，共分离得到151个菌株。经单孢分离纯化后，在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 斜面平板中于4 ℃保存。其中FQ-1～FQ-64和XY-1～XY-87分别指采自福泉和兴义的烟草赤星病菌菌株。

1.3 致病性测定

将烟草赤星病菌各菌株于25 ℃的PDA平板上培养6 d后，在菌落同一圆周上制取菌饼 (直径0.5 cm)，(刺伤) 接种于烟草叶片上。在人工气候箱中于25 ℃、12 h : 12 h (L : D) 条件下保湿培养10 d后观察发病情况，以接种无菌的琼脂块为对照，具有致病性的菌株才用于后续的鉴定与敏感性研究。

1.4 菌株的鉴定

基于形态特征和分子鉴定综合进行烟草赤星病菌的鉴定[4]。各供试菌株活化后转移至PDA平板上，于25 ℃ 黑暗培养7 d后观察菌落形态，并洗下分生孢子观察孢子形态。分子生物学鉴定时，采用上海生工生物公司的DNA快速提取试剂盒提取各菌株的基因组DNA。通过上游引物ITS1(GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)和下游引物ITS4 (GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)[7]扩增ITS序列，PCR反应采用50 μL体系，扩增程序为95 ℃ × 5 min，94 ℃ × 30 s，55 ℃ × 45 s，72 ℃ ×1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化回收后，送上海生工生物有限公司测序。

1.5 对啶酰菌胺敏感性测定

采用菌丝生长速率法[3]测定。在灭菌的PDA培养基中加入啶酰菌胺药液，啶酰菌胺的质量浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μg/mL。对于EC50值高于3.2 μg/mL的菌株，增设6.4 μg/mL的啶酰菌胺处理。将各菌株在PDA平板上预培养5 d后，从同一菌落外围制取直径为0.5 cm的菌饼，转接至上述含不同质量浓度啶酰菌胺的PDA平板中央，以不含药剂但含相同质量浓度的丙酮为对照 (0 μg/mL)。每处理重复3次。于25 ℃下黑暗培养6 d后测量各处理的菌落直径 (cm)，按 (1) 式计算菌落增长抑制率 (I)。

(1)式中：Dck为对照菌落增长直径，mm；Dt为处理菌落增长直径，mm。利用SPSS软件，通过药剂质量浓度对数值 (x) 与抑制率几率值 (y)之间的线性回归关系，求出毒力回归方程、EC50值及相关系数。

1.6 Sdh B基因序列分析

选择对啶酰菌胺敏感性最低 (EC50值最高) 的3个菌株并随机选取其他11个对啶酰菌胺敏感的菌株，对Sdh B基因序列进行扩增。上游引物为Sdh BSen-F (GTC CAA GGA AGA CCG CAA GA)；下游引物为Sdh BSen-R (TGA GCA GTT GAG AAT GGT ATG)[8]。PCR扩增程序为95 ℃ ×5 min，94 ℃ × 30 s，58 ℃ × 30 s，72 ℃ × 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 烟草赤星病菌菌株的形态和致病性

分离获得的不同烟草赤星病菌菌株经接种后对烟草叶片均有致病性，表现为形成圆形或斑驳状晕圈，干燥后病斑颜色转为棕褐色，但各菌株间的致病性存在显著差异。菌株间的菌落形态和孢子形态有较大差异 (图1)。菌落大多为圆形，少数为不规则圆形；随着培养时间的延长，菌落会由白色向灰色、褐色或墨绿至黑色转变，并伴随有黄褐色或黑色色素沉积。分生孢子在分生孢子梗上成串生长，形成倒立的棒槌状分生孢子链。分生孢子多胞，呈褐色或黑褐色，有纵、横隔膜，其中横隔1～8个，纵隔0～3个。所有菌株的ITS与交链格孢Alternaria alternata(Fr.)Keissl. 的ITS(KP694828.1) 的同源性均在99%以上。综合形态和分子鉴定结果，表明贵州省烟草赤星病菌为交链格孢A. alternata。

2.2 烟草赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性基线

采自贵州的102株烟草赤星病菌群体对啶酰菌胺的EC50值在0.186～5.818 μg/mL之间，平均EC50值为 (2.157 ± 1.112) μg/mL，其中有3株的EC50值大于5 μg/mL。以供试的102个菌株的EC50值为依据，从0 μg/mL开始，以0.5为组距，将赤星病菌群体 (n= 102) 的EC50值划分成12个区间，统计每个区间内的菌株频率，以区间值为横坐标，频率为纵坐标，获得啶酰菌胺对烟草赤星病菌各菌株EC50值的频率分布图，如图2所示为连续分布的单峰曲线，因此认为上述平均EC50值 (2.157 ± 1.112) μg/mL可以作为烟草赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性基线。

2.3 Sdh B基因序列

在所测定的11株啶酰菌胺敏感菌株和3株对啶酰菌胺敏感性最低的菌株中，其Sdh B基因第209位和第277位均出现无意义替换，密码子分别为GAC和CAT；FQ-39、XY-52和XY-61菌株第224位密码子发生替换，其中FQ-39和XY-52由TGC替换为CGC，导致编码的氨基酸发生C224R突变；XY-61菌株替换为GGC，导致发生C224G突变；FQ-17菌株第226位密码子由TCA替换为CCA，导致编码的氨基酸发生S226P突变，但这些突变与烟草赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性没有关联 (表1)。

表1 烟草赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性及Sdh B基因序列比较Table 1 Sensitivity to boscalid and comparison of Sdh B segments

3 结论与讨论

本研究发现，由贵州省烟草种植田间分离获得的烟草赤星病的病原菌均为交链格孢A. alternata。已有研究报道，不同烟区的烟草赤星病菌不完全相同，如吉林省和黑龙江省的烟草赤星病病原菌有交链格孢A. alternata、细极链格孢A. tenuissima、鸭梨链格孢A. yaliinficiens和长柄链格孢A.longipes4种[9]，而重庆市的烟草赤星病菌则只有交链格孢A. alternata[9]。之前有研究报道，贵州省烟草赤星病病原菌有交链格孢和长柄链格孢两种，而本研究结果表明，其只有交链格孢菌一种，这可能与采样地区不同等有关。另外，文献报道中分离获得的菌株未经过致病性测试[10]，而本研究所有菌株均进行了致病性测试。本研究还发现，不同菌株的形态特征和致病性有较大差异，这与前人报道的交链格孢的菌落颜色等形态变异大，而孢子链是重要的分类依据是一致的[11]。由于目前对A. alternata种的界限尚未明确界定，链格孢内种的关系仍存在许多争议[11]，后续还有待对贵州省烟草赤星病菌的多样性进行系统、深入分析。

本研究测定了贵州省烟草赤星病菌群体 (n=102) 菌丝生长对啶酰菌胺的敏感性。结果表明，啶酰菌胺对交链格孢的EC50值范围为0.186～5.818 μg/mL，平均EC50值为 (2.157 ± 1.112) μg/mL。前人研究发现，Sdh B发生H277Y/R等类型的突变是交链格孢和茄链格孢对SDHIs产生抗性的主要机制[12-13]。本研究发现，啶酰菌胺对3株赤星病菌的EC50值大于5 μg/mL，于是进一步分析了其Sdh B基因，结果发现，在第209位、277位和224位等密码子存在一定的核苷酸多样性，但这种核苷酸多样性与赤星病菌对啶酰菌胺的敏感性没有关联，说明其仍然属于敏感菌株。本研究中，赤星病菌群体的敏感性分布为连续的单峰曲线，所建立的敏感性基线可用于后续抗性监测。SDHIs属于单作用位点专化性杀菌剂，能防治多种病害，病原菌对其产生抗药性风险的等级为中至高等[12-13]。目前植物灰霉病菌已对其产生低水平抗性[6]，后续还需要进一步开展烟草赤星病对SDHIs的抗性风险评价，并对该类药剂应用后的田间抗性发展进行监测。