马拉硫磷对照品的制备

温芳，张秀英，郭桂芳，陆连寿，万仁玲，郝利华，巩忠福

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

马拉硫磷是一种较早应用的有机磷杀虫剂,主要以触杀、胃毒合熏蒸毒杀灭害虫，具有广谱、低毒、使用安全等特点。我国、美国及欧盟等均批准其作为兽药使用，美国[1]和欧盟[2]已将马拉硫磷及其制剂收录入药典中，并可提供马拉硫磷及其杂质的对照品，我国已将精制马拉硫磷原料及制剂收录入2017年版《兽药国家标准》[3](化学药品卷)中，但还未提供相关标准物质。

为控制马拉硫磷产品质量，满足兽药产品检验需求，本研究参照美国药典、欧洲药典以及我国2017年版《兽药国家标准》(化学药品卷)拟定了马拉硫磷对照品质量标准，依据该质量标准对马拉硫磷对照品候选物进行了全面质量控制，并以美国药典委员会提供马拉硫磷对照品作为溯源对照品，通过协作标定方法对马拉硫磷对照品候选物进行定值，经专家组审查，现已入库发放，填补了我国兽药标准物质研制的一项空白。

1 材料与方法

1.1 材料 马拉硫磷对照品(批号：1374408，含量99.2%)和异马拉硫磷对照品(批号：1349604，含量97%)，美国药典委员会提供；马拉硫磷对照品候选物(纯度99.2%)，山东省化学农药及中间体产品质量监督检验站提供；甲醇、丙酮，色谱纯；水为符合GB/T6682规定的一级水；高效液相色谱仪e2695，美国waters公司提供；气相色谱仪7890A，Agellent公司提供；XP105天平，METTLER公司提供；787KFTitrino水分测定仪，瑞士万通公司提供。

1.2 方法

1.2.1 相对密度 按《中国兽药典》(2015版)一部[4]相对密度测定方法中的比重瓶法测定。

1.2.2 鉴别

1.2.2.1 取本品 2 mL，加甲醇2 mL，摇匀，加1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，摇匀，静置2 min，再加0.5 mol/L硫酸溶液数滴，使溶液呈无色，加醋酸铜试液2 mL，生成深黄色沉淀；

1.2.2.2 高效液相方法 在含量测定项下记录的色谱图中，马拉硫磷对照品候选物溶液主峰的保留时间应与马拉硫磷对照品溶液主峰的保留时间一致。

1.2.3 检查

1.2.3.1 游离酸 取本品约2 g，精密称定，加无水乙醇20 mL和溴酚蓝指示液数滴，摇匀，用氢氧化钠滴定液(0.02 mol/L)滴定至溶液为蓝色，同时以空白试验校正。

1.2.3.2 异马拉硫磷[1-2]色谱条件：照含量测定项下的色谱条件进行试验，检测波长为210 nm，异马拉硫磷和马拉硫磷的相对保留时间分别为0.5和1.0。

测定法：精密称取异马拉硫磷对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的异马拉硫磷对照品溶液，精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取马拉硫磷对照品候选物适量，用甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含20 mg的马拉硫磷溶液，同法测定。平行测定2份异马拉硫磷对照品和2份马拉硫磷对照品候选物，按外标法以峰面积计算马拉硫磷对照品候选物中异马拉硫磷含量。

1.2.3.3 水分测定方法 按照《中国兽药典》(2015版)一部[4]水分测定法第一法费休氏法进行。

1.2.4 含量测定方法 色谱条件与系统适应性试验：用高效液相方法测定[1-3]。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(30 cm×3.9 mm,10 μm)；以甲醇-水(50∶30)为流动相；检测波长为254 nm；流速1.0 mL/min。理论板数按马拉硫磷峰计算不低于2500，与相邻峰的分离度应符合要求。

测定法：精密称取马拉硫磷对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含10 mg马拉硫磷对照品溶液，精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；精密称取马拉硫磷对照品候选物适量，同法配制并测定。按外标法以峰面积计算马拉硫磷对照品候选物中马拉硫磷含量。平行测定2份马拉硫磷对照品和5份马拉硫磷对照品候选物。

1.2.5 定值方法 协作标定方法： 3家单位协作标定；含量测定按照1.2.4 高效液相方法进行；每家单位均由2人进行测试；每人测试平行样不少于5份(每人测试用对照品至少应取2份)；单人平行样的相对标准偏差应小于0.5%，2人间的相对偏差应小于0.3%。3家单位协作标定，测定结果进行加权平均计算。

2 结果与分析

2.1 相对密度 测定结果为1.23。

2.2 鉴别

2.2.1 生成深黄色沉淀；

2.2.2 马拉硫磷对照品 候选物溶液主峰保留时间为16.999，马拉硫磷对照品溶液主峰保留时间为16.994，保留时间一致。图谱见图3和图4。

2.3 检查

2.3.1 游离酸 用空白试验校正后，测得游离酸的结果为0.02%；

2.3.2 异马拉硫磷 将浓度约为0.1 mg/mL的2份异马拉硫磷对照品溶液和浓度约为20 mg/mL的2份马拉硫磷对照品候选物溶液，分别进样2针。异马拉硫磷和马拉硫磷的相对保留时间分别为0.5和1.0。按外标法计算马拉硫磷对照品候选物中异马拉硫磷的含量，其平均值为0.06%，修约为0.1%，具体实验结果见表1。异马拉硫磷对照品图谱见图1，马拉硫磷对照品候选物图谱见图2。

表1 马拉硫磷对照品候选物中异马拉硫磷含量测定结果

图1 异马拉硫磷对照品图谱

图2 马拉硫磷对照品候选物图谱

2.3.3 水分测定结果 用3份重蒸水标定费休氏试液，得F值为3. 564 5；测定3份供试品的水分平均值为0.1%。

2.3 含量测定结果

2.3.1 系统适应性结果 将浓度约为10 mg/mL的马拉硫磷对照品溶液连续进样5针，其峰面积的相对标准偏差为0.2%，理论塔板数大于2500，与相邻峰的分离度符合方法要求。

2.3.2 含量测定结果 将浓度约为10 mg/mL的2份马拉硫磷对照品溶液和5份马拉硫磷对照品候选物溶液，分别进样2针，按外标法计算5份马拉硫磷对照品候选物的含量，其含量平均值为98.77%，修约为98.8%，实验结果表明该候选物满足制备马拉硫磷对照品原料的要求。具体实验结果见表2。马拉硫磷对照品图谱见图3，马拉硫磷对照品候选物图谱见图4。

图3 马拉硫磷对照品图谱

图4 马拉硫磷对照品候选物图谱

表2 马拉硫磷对照品候选物含量测定结果

3 定值结果

3.1 协作标定结果 协作标定结果、加权平均计算结果和合并计算结果分别见表3、表4和表5：

表3 协作标定结果汇总表

表4 3家单位协作标定结果的加权平均值

表5 3家单位标定结果加权平均值的合并计算

3.2 定值结果 对3家单位协作标定结果进行加权平均计算，得出马拉硫磷对照品候选物含量的加权平均值为98.99%，相对标准偏差为0.3%，修约为99.0%，所以本研究制备的马拉硫磷对照品含量赋值为99.0%。

4 讨论与结论

WHO发布的化学对照品一般指导原则规定用于含量测定用对照品需要至少3家实验室对其进行协作标定；中国兽医药品监察所制定的《兽药标准物质研制技术规范(试行)》也规定新兽药标准物质采用溯源标准物质定值时，原则上应由2个以上(含2个)外部实验室协作标定，所以本次制备的马拉硫磷对照品采用外标法，由3家单位协作标定来定值，保证了马拉硫磷对照品含量赋值的准确性和重现性。

我国2017年版《兽药国家标准》(化学药品卷)收录的马拉硫磷原料含量测定方法为气相法，但在研究过程中发现，通过改变柱温、气体流速、分流比等色谱条件[5]，马拉硫磷主峰中仍有1小峰未能完全分离，所以用气相方法测定马拉硫磷含量存在定量准确性的问题，所以本研究参照美国药典和欧盟药典用高效液相方法作为制备马拉硫磷对照品的含量测定方法。

当对照品用于专属性的含量测定方法时，确定杂质的含量是很重要的。本研究参照美国药典及欧盟药典质量标准增加了对杂质异马拉硫磷的质量控制，保证了马拉硫磷对照品含量定值结果的准确性。

3家单位协作标定结果相对标准偏差为0.3%，满足用高效液相方法对标准物质定值的统计学要求。