新型表面麻醉剂的口腔黏膜表面麻醉效果研究

曾 东 牛 娇 李长义 常 津 牛光良▲

1.北京市中西医结合医院，北京 100039；2.山西医科大学第二医院，山西太原 030001；3.天津医科大学口腔医院，天津 300070；3.天津大学生命科学学院纳米医学研究所，天津 300072

口腔表面麻醉剂具有操作简单、无痛、无损伤、减少患者对疼痛恐惧感和避免注射疼痛等优点[1]。但是，目前商品化的表面麻醉剂普遍存在起效慢、作用表浅、麻醉效果不佳等缺点[1-3]，开发渗透力强、起效快、麻醉效果好的表面麻醉剂一直是众多研究者不断探索的热门研究课题之一[4-6]，尤其以脂质体为载体的透皮给药系统为近年来新的研究方向[2]。

本课题组与天津大学材料学院纳米生物技术研究所共同自主研发了新型表面麻醉剂-载盐酸利多卡因葡聚糖基纳米高分子脂质体（Lidocaine hydrochloride lysine -linoleic acid modified dextran polymeric lipid vesicles，LID-LLD-PLVs），其是以赖氨酸、亚油酸、葡聚糖和胆固醇合成的葡聚糖基纳米高分子材料为载体，包载利多卡因（Lidocaine，LID）合成[7]，其各项理化性能良好[7]，并具有优越的透皮性能，可有效增加LID的透皮量和渗透深度[8]。本课题组前期豚鼠皮肤刺激性实验显示对皮肤无刺激性，MTT 毒性实验结果为50、100 μg/ml的LID-LLD-PLVs 细胞毒性为0 级（待发表）。为了探讨LID-LLD-PLVs的口腔黏膜麻醉效果，本研究以家兔下颌前牙唇侧牙龈为给药部位，通过针刺实验和颏神经动作电位实验对其进行综合评价。

1 对象与方法

1.1 实验对象

1.1.1 材料与试剂

LID-LLD-PLVs、载盐酸利多卡因传统脂质体（Lidocaine hydrochloride conventional liposomes，LIDCLs），LID 含量2%，天津大学材料学院纳米生物技术研究所实验室自制；盐酸利多卡因注射液（Lidocaine hydrochloride injection，LID-IJ），0.1 g/5 ml，批号：201 40312，上海禾丰制药有限公司。

1.1.2 仪器与设备

BL-420 生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司。

1.1.3 实验动物及分组

新西兰兔18 只，健康、口颌系统无异常，8 月龄，雌雄、颜色不限，体重（2.0±0.2）kg，购于北京隆安实验动物养殖中心，生产许可证号：SCXK（京）2014-0003，动物质量合格证号：11401400000479。常温普通饲料饲养1 周。本实验经天津医科大学药物实验伦理委员会批准。将18 只兔按体重分层随机分组的方法分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，每组6 只。

1.2 实验方法

1.2.1 牙龈针刺实验

将兔以仰卧位固定于兔手术台，于下颌前牙唇侧牙龈中间划定约2 mm×5 mm的给药区。阴性对照组在给药区牙龈涂抹LID-IJ 0.5 ml、阳性对照组在给药区牙龈涂抹LID-CLs 0.5 ml、实验组在给药区牙龈涂抹LID-LLD-PLVs 0.5 ml，每5 min 针刺给药区牙龈，按上、下、左、右、中顺序针刺5 下，两针刺时距3～5 s，以开颌反射为疼痛指征，记录疼痛次数。疼痛≤2 次视为麻醉起效，疼痛≥3 次视为无效。记录起效时间并计算持续时间，所有家兔均进行实验。

1.2.2 颏神经动作电位实验

1.2.2.1 颏神经分离 兔耳缘静脉注射20%乌拉坦（3 ml/kg）行全麻后取仰卧位，存在睫毛反射，但安静不动。室温20℃，于下颌下缘中部内侧约1 cm 处剃毛，碘伏消毒，平行下颌骨下缘作口外切口，于骨面剥离软组织，在颏孔处暴露颏神经。钝性分离，接记录电极并固定。下颌前牙唇侧牙龈插入刺激电极，在刺激和记录电极间下颌软组织内插入一针状电极接地。见图1。

图1 颏神经的分离

1.2.2.2 初始动作电位记录 连接BL-420 生物机能实验系统，执行“动作电位引导”实验模块。参数设置为：调整刺激强度1 V，波宽1.0 ms，时间常数0.01 s，高频滤波5 kHz。

1.2.2.3 给药后动作电位记录 给药方法同“1.2.1”，给药后每隔5 min 给予1 次电刺激。记录动作电位幅度（action potential amplitude，APA），计算最大APA 抑制率[ 抑制率（%）=（用药前APA -用药后APA）×100 %/用药前APA]及出现时间。所有兔子均进行实验。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验，重复测量资料采用重复测量方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组牙龈针刺实验结果比较

阴性对照组在给药后90 min 内未出现明显麻醉效果。实验组起效时间为（26.67±5.16）min，低于阳性对照组的（40.83±5.85）min，差异有统计学意义（t=4.449，P ＜0.05）；实验组麻醉持续时间为（34.17±3.76）min，与阳性对照组[（29.17±6.65）min]比较，差异无统计学意义（t=1.604，P ＞0.05）。

2.2 三组家兔颏神经APA 抑制率比较

整体分析发现：组间比较、时间点比较及交互作用差异均有统计学意义（均P ＜0.05），提示三组药物作用的颏神经APA 抑制率存在差异。进一步两两比较，组内比较：阴性对照组和阳性对照组50 min APA抑制率高于其他时间点，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），实验组40 min APA 抑制率高于其他时间点，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；组间比较：实验组各时间点APA 抑制率高于阳性对照组，阳性对照组50 min内APA 抑制率高于阴性对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 三组家兔颏神经APA 抑制率比较（±s）

表1 三组家兔颏神经APA 抑制率比较（±s）

注：与本组10 min 比较，aP ＜0.05；与本组20 min 比较，bP ＜0.05；与本组30 min 比较，cP ＜0.05；与本组40 min 比较，dP ＜0.05；与本组50 min 比较，eP ＜0.05；与本组60 min 比较，fP ＜0.05；与本组70 min 比较，gP ＜0.05；与本组80 min 比较，hP ＜0.05；与阴性对照组比较，*P ＜0.05；与阳性对照组比较，#P ＜0.05。APA：动作电位幅度

3 讨论

脂质体作为药物载体的透皮给药系统已覆盖很多领域药物的研究[9-14]。在表面局麻药的研究中尤以LID 脂质体的研究居多，也早已有上市使用，但尚未解决透皮效率低、药效仅限于皮肤/黏膜表面浅表[15-16]，麻醉难以显效[17]等难题，部分药物甚至因此停产。在口腔临床中，因为现有表面麻醉药对牙龈、上腭等角化黏膜的穿透力差，所以应用更少。

以往关于口腔局麻药麻醉效果的研究几乎全部为人体实验[18-21]。因为LID-LLD-PLVs 为一新型制剂，尚未达到进行人体实验条件，只能通过动物实验来评价其表面麻醉效果。考虑到通过动物的疼痛反应来判断麻醉效果容易出现较大误差和动物在清醒状态下做出的抗拒、挣扎动作会给疼痛反应的判定造成干扰，所以本研究选择针刺实验和颏神经动作电位实验来综合评价LID-LLD-PLVs的口腔黏膜表面麻醉效果。

3.1 牙龈针刺实验

针刺实验是对局麻药作用评价常用方法之一，多数研究者通常采用豚鼠背部针刺实验法[22]。但LIDLLD-PLVs 是拟用于口腔表面的麻醉药，作用部位多为牙龈，为角化黏膜，比豚鼠的皮肤敏感性差，为了实验更有针对性，本研究选择了家兔的下前牙唇侧牙龈为给药部位进行针刺实验。本研究结果显示，LID-IJ表面麻醉未显效，LID-CLs和LID-LLD-PLVs 均具有表面麻醉效果，且以LID-LLD-PLVs 起效更快，持续时间两者比较，差异无统计学意义。分析原因可能是LID-LLD-PLVs 渗透速度快于LID-CLs[8]，所以起效更快，但是渗透持续时间接近一致，所以麻醉效果持续时间比较无差异。

3.2 LID-LLD-PLVs 对家兔颏神经动作电位的影响

国内外均有学者使用神经电生理实验方法做局麻药对牙髓疼痛的镇痛作用研究[23-25]，实验动物多为猫、家兔和大鼠，实验方法多选用记录二腹肌动作电位或下牙槽神经动作电位。关于表面麻醉药对牙龈等口腔黏膜镇痛作用的电生理实验鲜见报道。家兔下颌前牙唇侧牙龈受颏神经支配，颏神经为下牙槽神经的终末支，选择记录颏神经动作电位比选择记录支配所有下颌牙齿、牙槽骨的下牙槽神经动作电位更加定位准确、反应灵敏。

颏神经动作电位实验结果显示LID-LLD-PLVs对颏神经动作电位抑制快、抑制效果强，提示其表面麻醉效果强于LID-CLs和LID-IJ，与针刺实验结果一致。LID-IJ 对颏神经APA 有轻度抑制作用，但抑制作用较弱，持续时间具有一过性特点。这点与针刺实验结果稍有差异，分析原因可能为LID-IJ表面麻醉效果甚微和动物的挣扎干扰了对疼痛反应的判定。

本研究中，两项实验结果均显示新研制的LIDLLD-PLVs 较LID-CLs和LID-IJ 起效快、麻醉效果好，分析其原因可能为：LID-LLD-PLVs 具有两亲性[7]，更容易透过角质层的屏障作用；粒径小，为纳米级，平均粒径仅为54.1 nm[7]，所以相对于直径为250 nm的LID-CLs 更容易穿透角质层；具有较高的正电位，zeta电位为+27.40[7]，明显高于LID-CLs（表面电位为+3.76），正电位越高越能更好地改变角质层脂类分子的紧密排列[25]，增强其流动性，形成渗透通路，而增加渗透速率；葡聚糖对脂质体表面进行修饰，能提高脂质体的稳定性，促进药物渗透的能力。

新研制的口腔表面局麻药LID-LLD-PLVs 起效较快，麻醉效果较好，具有良好的作为口腔黏膜表面麻醉剂的临床应用前景。