梓醇对糖尿病小鼠视网膜病变的影响及作用机制

吴 震 杜 秋

南京中医药大学附属南京中医院药学部，江苏南京 210022

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见的微血管并发症[1]。中医学中DR 属于“消渴目病”范畴，是气阴两虚之症，阴虚日久则瘀血阻络致目视物缥缈，治则以益气养阴为法[2-3]。中药地黄味甘性寒，清热滋阴。梓醇是从地黄块根中提取的一种环烯醚萜苷类化合物[4]，具有降血糖、抗炎、抗肿瘤和抗氧化应激等功效[5-7]。本研究旨在探讨梓醇对糖尿病小鼠视网膜病变的作用，并进一步阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性8 周龄KK-Ay和C57BL/6J 小鼠购于北京华阜康公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。小鼠饲养于温度（22±2）℃、湿度（55±5）%、12 h 日夜交替照明的SPF 级环境中。动物实验获南京中医药大学伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

梓醇（货号：Z-005-190523，成都瑞芬思）；氨基胍（货号：079K1734V，美国Sigma）；白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和晚期糖基化终末产物（advanced glycolylation end product，AGE）酶联免疫吸附试验试剂盒（批号：202004，上海酶联）；血管内皮钙黏着蛋白（VE-cadherin）和AGE 受体（advanced glycolylation end product receptor，RAGE）抗体（货号：ab33168、ab3611，英国Abcam）；磷酸化核因子-κB p65（phosphorylated nuclear factor-κB p65，P-NF-κB p65）抗体（货号：#8242s、#3039s，美国CST）；血糖仪（Contour TS，德国拜耳）；酶标仪（Synergy HT，美国Bio Tek）。

1.3 研究方法

1.3.1 分组及给药 高脂高糖饲料喂养KK-Ay 小鼠4 周后，将其按随机数字表法分为模型组、氨基胍组和梓醇低、高剂量组，另取基础饲料喂养的C57BL/6J小鼠为空白组，每组各7 只。氨基胍组灌胃氨基胍100 mg/（kg·d），梓醇低、高剂量组分别灌胃梓醇50、100 mg/（kg·d），空白组和模型组灌胃生理盐水100 mg/（kg·d）。分别于干预前、干预4 周后、干预8 周后检测五组血糖水平。干预8 周后，摘眼球取血，并分离出视网膜组织，用于后续检测。

1.3.2 血清IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 水平检测 按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书步骤操作，用酶标仪检测吸光度值。

1.3.3 视网膜HE 染色 多聚甲醛固定视网膜，乙醇分级脱水，石蜡包埋后切片。经HE 染色，于显微镜下随机视野拍照。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）采用Image J 软件进行计数。

1.3.4 视网膜VE-cadherin、RAGE、P-NF-κB p65蛋白检测 视网膜组织总蛋白于凝胶中电泳分离后，转至印迹膜上，封闭后加入一抗（1∶1000 稀释）4℃过夜。次日洗膜后，加入二抗（1∶5000 稀释）孵育后显影。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，各时间点血糖水平比较采用重复测量的方差分析，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组干预前、干预4 周后、干预8 周后血糖水平比较

整体分析发现：五组干预前、干预4 周后、干预8 周后血糖水平组间比较、时间点比较及交互作用差异均有统计学意义（P ＜0.05）。进一步两两比较，组内比较：模型组干预8 周后血糖水平高于干预前，梓醇低剂量组干预8 周后血糖水平均低于干预前，梓醇高剂量组干预4 周后及干预8 周后血糖水平均低于干预前，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。组间比较：模型组干预前、干预4 周后、干预8 周后血糖水平均高于同一时间点的空白组，梓醇低剂量组干预8 周后血糖水平低于同一时间点的模型组，梓醇高剂量组干预4 周后、干预8 周后血糖水平均低于同一时间点的模型组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 五组干预前、干预4 周后、干预8 周后血糖水平比较（±s）

表1 五组干预前、干预4 周后、干预8 周后血糖水平比较（±s）

注：与本组干预前比较，aP ＜0.05；与本组干预4 周后比较，bP ＜0.05；与同一时间点空白组比较，cP ＜0.05；与同一时间点模型组比较，dP ＜0.05

2.2 五组视网膜病理改变及RGC 数量比较

空白组视网膜表面光滑平整，结构清晰完整；模型组视网膜结构疏松、厚度变薄，视网膜细胞排列无序；梓醇低剂量组视网膜结构疏松、厚度较薄；梓醇高剂量组视网膜结构、细胞排列及视网膜厚度较模型组有所改善，见图1。干预8 周后，模型组RGC 数量少于空白组；梓醇高剂量组RGC 数量多于模型组，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图2。

图1 五组视网膜病理改变（HE 染色，400×）

图2 五组视觉膜神经节细胞数量比较（n=7）

2.3 五组血清IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 比较

干预8 周后，模型组IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 水平均高于空白组，梓醇低、高剂量组IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 水平均低于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图3。

图3 五组血清IL-1β、TNF-ɑ、VEGF、AGE 比较（n=7）

2.4 五组视网膜VE-cadherin、RAGE、P-NF-κB p65蛋白表达比较

干预8 周后，模型组VE-cadherin表达低于空白组，RAGE、P-NF-κB p65 蛋白表达高于空白组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。干预8 周后，梓醇低、高剂量组VE-cadherin表达高于模型组，RAGE、PNF-κB p65 蛋白表达低于模型组，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见图4。

图4 五组视网膜VE-cadherin、RAGE、P-NF-κB p65 蛋白表达比较（n=7）

3 讨论

DR 是导致糖尿病患者失明的最常见原因。目前，DR 主要通过玻璃体切割术、激光来治疗，但手术和激光可能会导致周边视力丧失或恶化，甚至产生糖尿病性黄斑水肿[8-11]。因此，亟需寻找有效的药物来治疗DR。自发性糖尿病KK-Ay 小鼠用于DR 研究已有多篇文献报道[12-15]，其具有个体差异性小、更接近人类发病的特点。

研究显示[16]，地黄可有效防治DR，本研究在此基础上进一步探究其特征性活性成分梓醇对DR的影响。视网膜缺血缺氧、血管通透性增加和新生血管形成是DR的主要特征[17-18]。血-视网膜屏障通透性的增加通常归因于慢性高血糖的刺激，以及AGE、氧自由基和生长因子的积累[19]。长期高血糖状态下，AGE 在体内大量蓄积，与RAGE 结合后激活NF-κB[20-22]。NF-κB是损伤相关的一种多效调节剂，可调节下游多种炎症因子的表达，其中IL-1β 激活小胶质细胞，促进DR的神经炎性反应[23]。TNF-α 会刺激视网膜血管内皮细胞增殖，导致视网膜血管狭窄、闭塞及新生血管的形成[24-26]。

此外，NF-κB 可引起视网膜周细胞凋亡，刺激VEGF生成，其通过减少黏着蛋白的分布来改变视网膜血管的通透性[27-29]。本研究显示，梓醇低、高剂量组血糖、IL-1β、TNF-α和VEGF 水平均低于模型组，并上调视网膜VEcadherin 蛋白表达高于模型组，视网膜组织的病理学损伤也有一定改善，提示梓醇是治疗DR的潜在分子。进一步的机制研究显示，梓醇低、高剂量组血清AGE 低于模型组，RAGE、P-NF-κB p65 蛋白表达低于模型组，提示梓醇可能是通过抑制AGE/RAGE/NF-κB 信号通路来调控炎症因子水平，恢复视网膜黏着蛋白，从而改善视网膜血管通透性，发挥防治DR的作用。但本研究仅探讨了梓醇对糖尿病小鼠视网膜病变的作用，后续需通过体外视网膜神经节细胞进一步研究梓醇的作用及机制，为探索抗DR的新药提供更充分的理论依据。