基于网络药理学探讨十枣汤治疗肝硬化腹水的作用机制

王艳萍 李文静 洪 博

齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

肝硬化是功能性肝结构被非功能性纤维化组织逐渐替代为特征的终末期肝脏紊乱[1]。腹水是肝硬化最常见的并发症，腹水的出现是肝硬化患者不良预后的一个标志，3 年病死率高达50%[2]。因此，提高肝硬化患者的生活质量，减少肝硬化腹水（简称“肝腹水”）的并发症及病死率变得越来越重要。

肝腹水相当于中医“膨胀”“单腹胀”范畴。对于肝腹水的治疗，中医多采用“利水”“逐水”等方法。十枣汤由甘遂、芫花、大戟和大枣组成，是峻下逐水的代表性方剂[3]。近年来，研究发现十枣汤在临床上多用于治疗腹水[4-5]，但对十枣汤抗肝腹水的作用机制少有研究。

1 材料与方法

1.1 十枣汤中化合物的收集

通过TCMSP 数据库[6]检索十枣汤活性成分。

1.2 活性化合物与靶点筛选

通过口服生物利用度（oral bioavailability，OB），≥30%药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18[7-8]对十枣汤中化合物进行筛选并得到靶点。UniProt 数据库对得到的靶点进行基因名转换。

1.3 肝腹水作用靶点筛选

以“liver cirrhosis”为关键词在GeneCards[9]数据库进行检索，根据疾病与靶点间的相关度进行筛选，选出相关靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）的构建

利用Venny 2.1 在线软件作图工具平台对十枣汤成分靶点与疾病靶点取交集，得到十枣汤抗-肝腹水交集靶点。将其导入String 数据库，构建PPI 网络。

1.5 基因富集通路可视化分析

将药物-疾病靶点导入Metascape 数据库，进行GO 与KEGG 通路富集分析，在微生信在线作图平台进行可视化。

1.6 药物-化合物-靶点-通路网络构建

将药物、化合物、十枣汤-疾病靶点及KEGG 信号通路导入Cytoscape 3.8.0 中，构建药物-化合物-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 十枣汤活性成分与靶点收集

通过TCMSP 数据库收集十枣汤中“甘遂”“芫花”“大枣”“京大戟”化合物共244 个。其中满足OB≥30%，DL≥0.18的成分共58 个，包含靶点217 个。十枣汤活性成分信息见表1。

表1 十枣汤部分活性成分

2.2 肝腹水靶点

通过Genecards 数据库获得肝腹水相关靶点2001 个，按得分≥5 选取后得到914 个靶点。

2.3 PPI 网络

十枣汤-肝腹水交集靶点共99 个，见图1。交集靶点PPI 网络见图2。图中共87 个节点，419 条边，平均局部聚类系数为0.479，平均节点度为8.46。

图1 十枣汤-肝腹水交集靶点Venn 图

图2 十枣汤抗肝腹水蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.4 靶点通路可视化

十枣汤可能通过蛋白质、转录因子等结合调节细胞增殖和凋亡等过程发挥抗肝腹水作用，见图3（封四）。99 个靶点共得到160 条KEGG 通路，最重要的KEGG 信号通路有10 条，见图4（封四）。

图3 GO富集分析图

图4 KEGG通路富集分析图

2.5 药物-化合物-靶点-通路网络

药物-代合物-靶点-通路网络中包括4 种药材，25 个化合物，138 个节点及617 条边，排名前三的化合物为槲皮素、木犀草素、山柰酚，分别能与148、41、30 个靶点相互作用。对靶点进行分析，排名前五的靶点为PTGS2、RXRA、CASP3、AKT1 与JUN。对通路进行分析，排名前三的通路为癌症信号通路、乙型肝炎通路、PI3K/AKT 信号通路。见图5。

图5 十枣汤中化合物-靶点-通路网络图

3 讨论

本研究初步筛选出槲皮素、山柰酚、木犀草素等25 个活性成分，最终构建出具有138 个节点与617 条边的复杂网络图，阐释了中药复方制剂治疗疾病具有多成分、多靶点、多路径的特点。

从靶点方面：①PTGS2 在慢性丙型肝炎患者的活检肝脏样本中过表达，导致进行性肝纤维化，从而导致肝硬化及肝癌[10-11]。有研究发现[12]，小鼠肝硬化中COX2 基因表达水平和lncRNACOX2 核糖核酸表达水平均有所增加。②CASP3 能够产生促炎症、血液动力学活性的微泡，这些微泡在肝脏内产生重要的生物学效应[13]。CASP3 与裂解的CASP3 在肝纤维化形成过程中发挥重要的作用[14]。③JUN 在小鼠模型中成纤维细胞的细胞周期调节非常重要，同时，JUN 能够促进肝细胞与角质形成细胞的增殖[15-16]。④AKT 被激活后，能够磷酸化下游的mTOR 等靶蛋白，从而调节细胞的增殖、分化与凋亡[17-18]。

从通路方面：①乙型肝炎通路：大量的研究已经显示[19-20]，慢性乙肝演变成为肝硬化，关键的致病机制主要是病毒和机体细胞免疫反应共同作用的结果。目前已经有研究证实[21]，慢性乙肝患者中Treg/Th17 平衡失调可以导致持续性乙肝病毒感染和炎症性肝损伤。②PI3K/AKT 信号通路：研究显示[22]，随着肝星状细胞的激活、增殖，并且细胞外基质在肝脏中的合成或降解失衡，会导致肝纤维化，而PI3K/AKT 信号通路在此过程中具有重要作用。此外，PI3K/AKT 信号通路还可以使转化生长因子-β 诱导上皮间质转化导致肝硬化[23]。③微小核糖核酸在肝脏中参与肝细胞的增长及应激反应等，可反映肝脏中肝细胞和肝组织的状态，在肝硬化和肝癌的发展中起到重要作用[24]。尤其是miR21 会诱导上皮间质转化，导致肝硬化[25]。