基于网络药理学研究白术-黄芪-枳实组方治疗帕金森病便秘的作用机制及实验验证

包仲明 文黛薇 陆品刚 黄舞标 唐国文

1.广西壮族自治区梧州市中医医院脑病科，广西梧州 543002；2.广西中医药大学第六附属医院神经内科，广西梧州 543002；3.广西壮族自治区梧州市中医医院脾胃病科，广西梧州 543002；4.广西壮族自治区梧州市中医医院康复科，广西梧州 543002

帕金森病便秘是指帕金森病患者的一种非运动症状，病因主要是肠胃蠕动功能下降，给患者生活质量带来严重的不良影响[1]。帕金森病患者中很大一部分会发生便秘，即使不发生便秘，也有部分患者发生排便频率降低。帕金森病便秘原因比较复杂，可能由多种原因引起，帕金森病本身可能会伴随便秘，也可能因服用治疗帕金森病药物副作用而加重便秘的症状。因此帕金森病便秘可能与肠神经系统功能障碍、中枢神经系统疾病、药物治疗、饮食变化或体力活动有限有关[2]。中药具有多靶点的作用优势，在帕金森病便秘的治疗中具有良好的前景[3]，但其具体的作用机制尚未明确，需要进一步探讨。全国老中医药专家文黛薇教授认为脾胃是气机升降的枢纽，人体精气的升降运动有赖于脾胃居于其中而主宰。人以脾胃为后天之本，若脾胃受损，气血化生障碍，元气不充，正虚邪犯，百病由生。由此可见，中焦脾胃能影响其余诸脏的生理功能，中气足则四脏皆健，脾胃旺以安五脏。故在临证中，应谨遵“调治百病，扶土为先”之旨，将其应用于诸多疾病的诊治过程中，并始终重视顾护脾胃。白术-黄芪-枳实组方可在健脾胃益气基础上，治疗帕金森病便秘症状[4]。因此，本研究拟结合网络药理学方法探讨白术-黄芪-枳实组方治疗帕金森病便秘作用机制并进行实验验证。

1 材料与方法

1.1 白术-黄芪-枳实组方的化合物及其作用靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）中分别检索白术、黄芪和枳实的活性化合物，筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为标准，同时结合相关文献[7-13]，对化合物进行筛选。在TCMSP 中查找各有效化合物所对应的基因靶点，用于后续分析。

1.2 帕金森病便秘靶点基因收集

在GeneCards 数据库中以“帕金森病便秘”为关键词检索其相关基因，与白术-黄芪-枳实组方中有效化合物作用的靶点基因进行比较，筛选出白术-黄芪-枳实组方用于帕金森病便秘的作用靶点并绘制韦恩图，靶点基因用于后续生物功能及信号通路分析。

1.3 有效靶点基因及蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络分析

构建白术-黄芪-枳实组方化合物-帕金森病便秘的靶点关系网络，并在Cytoscape 软件中进行可视化，初步分析白术-黄芪-枳实组方治疗帕金森病便秘的作用机制。同时将有效靶点输入String 数据库中，选择“人”作为物种，以靶点蛋白互作评分＞0.7 为标准，获取有效靶点PPI 网络。

1.4 有效靶点GO 富集分析及KEGG 通路分析

将白术-黄芪-枳实组方的靶点输入生物学信息注释数据库（database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID），对筛选所得化合物靶点进行GO 生物学过程富集分析。利用KEGG Mapper功能将白术-黄芪-枳实组方化合物作用靶点在其与帕金森病便秘相关的作用通路上标注。

1.5 药物及试剂

白术-黄芪-枳实组方浓缩液（方药组成如下：白术40 g、黄芪15 g、枳实15 g），由广西壮族自治区梧州市中医医院药房提供，该组方经煎煮后浓缩，使每1 ml 浓缩液中含2 g 生药。洛哌丁胺（中国药品检验总所，批号：100300）、美多芭（上海罗氏）、聚乙二醇（马应龙药业，批号：20082092）。RNA 提取试剂盒（广州美基公司，批号：R4121-02B）、逆转录试剂盒（Prime ScriptTM，批号：RR055A/B）、PCR 引物（美国赛默飞，批号：450006）。丝裂原激活蛋白激酶8（mitogen-activation protein kinase 8，MAPK8）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、MYC、胱天蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease 3，Caspase3）一抗（北京中杉金桥，TA809895、TA500067、TA336584、TA336456）。

1.6 实验动物、造模及干预

选取6 周龄健康清洁级雄性SD 大鼠20 只，平均体重（180±20）g，购于广西医科大学实验动物中心（生产许可：SCXK 桂2020-0003，使用许可：SYXK 桂2020-0004），其中5 只为正常组，15 只采用双靶点注射6-羟基多巴胺，建立帕金森病模型，注射药物3 周后，大鼠逐渐开始出现毛色变黄、弓背、震颤、步态不稳等帕金森病表现，4 周后其行为学评分均达到2 分以上为造模成功[5]。进一步使用洛哌丁胺3 mg/kg，1 ml 生理盐水稀释后进行灌胃6 d[6]。于末次给药2 h后，20 只大鼠均灌胃5%活性炭-阿拉伯树胶悬液，灌胃后记录首粒黑便的排出时间，当15 只帕金森病模型大鼠的首粒黑便平均排出时间长于正常组且差异有统计学意义（P <0.05）时，视为帕金森病便秘模型造模成功。本研究涉及的实验动物，研究过程遵循《赫尔辛基宣言》有关生物医学研究的伦理要求。

将15 只帕金森病便秘模型大鼠根据随机数字表法分为模型组、阳性对照组、实验组，每组各5 只。实验组给予10 ml/kg 白术-黄芪-枳实组方浓缩液灌胃；阳性对照组给予美多芭50 mg/kg和聚乙二醇1 mg/kg进行灌胃；正常组、模型组用等量的生理盐水进行灌胃，均1 次/d，持续2 周。最后用2.5 ml/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，处死并取结肠组织。

1.7 mRNA表达检测

根据网络药理学分析结果及参考文献[14-15]，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测四组结肠组织中相关基因表达量。试剂盒提取四组结肠组织中相关mRNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为参考。按照逆转录试剂盒将其转录为cDNA，用qRT-PCR 进行扩增及定量分析。

1.8 Western blot 检测

取四组结肠组织于低温冰盒内剪碎后并裂解，根据BCA 法测定蛋白浓度后进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加入稀释相关基因的一抗，按1∶200 稀释后至于4℃冰箱中孵育过夜，洗膜后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，至于37℃恒温箱中孵育1 h。显影后使用凝胶成像系统拍照分析，用β-actin 蛋白进行校正。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 7 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用Tukey 法进行两两比较。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白术、黄芪和枳实的活性生物化合物

白术、黄芪和枳实共收集到50 种活性生物化合物，主要包括3β-acetoxyatractylone、quercetin和naringenin等。见表1。

表1 白术、黄芪和枳实中筛选的50 种活性生物化合物

2.2 白术-黄芪-枳实组方的靶点筛选

白术-黄芪-枳实组方作用靶点共2448 个，筛选的活性化合物相对应的靶点共116 个，帕金森病便秘相关的靶点共2559 个，二者取交集后得到白术-黄芪-枳实组方可能作用于帕金森病便秘的靶点84 个。见图1、表2。

表2 白术-黄芪-枳实组方可能作用于帕金森病便秘靶点

图1 帕金森病便秘与白术-黄芪-枳实组方作用靶点交集的韦恩图

2.3 白术-黄芪-枳实组方活性化合物-帕金森病便秘靶点网络构建与分析

白术-黄芪-枳实组方与帕金森病便秘之间的靶点网络图中共有114 个节点，见图2。PPI 网络图中相互作用节点共648 个，将蛋白连接节点最多的蛋白以柱状图的形式表示，相互作用节点最多的为MAPK8，共58 个，见图3。

图2 白术-黄芪-枳实组方活性化合物-帕金森病便秘作用靶点网络图

图3 白术-黄芪-枳实组方与帕金森病便秘作用靶点网络构建与分析

2.4 白术-黄芪-枳实组方-帕金森病便秘靶点的生物学功能及信号通路分析

GO 分析共富集到111 条生物过程，主要包括泛素样蛋白连接酶结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、DNA 结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡、核受体活性等生物过程，见图4（封三）。KEGG 分析富集结果显示白术-黄芪-枳实组方靶点主要富集在PI3K-Akt、Hepatitis B、MAPK和neurodegenerationmultiple diseases 等信号通路上，见图5（封三）。

图4 白术-黄芪-枳实组方与帕金森病便秘相关靶点GO 富集分析图

图5 白术-黄芪-枳实组方与帕金森病便秘相关靶点信号通路气泡图

2.5 四组MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 基因表达量比较

模型组MAPK8 基因表达量均低于正常组，IL-6、MYC、Caspase3 基因表达量均高于正常组，实验组MAPK8 基因表达量高于模型组，IL-6、MYC、Caspase3基因表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见图6。

图6 四组MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 基因表达量比较

2.6 四组MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表达量比较

模型组MAPK8 蛋白表达量低于正常组，IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表达量均高于正常组，实验组MAPK8 蛋白表达量高于模型组，IL-6、MYC、Caspase3蛋白表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见图7。

图7 四组MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表达量比较

3 讨论

便秘是帕金森病患者最容易出现的肠道并发症，同时也有研究表明便秘作为帕金森病的非运动症状，会早于帕金森病运动症状出现[16]。便秘的加重会导致帕金森病病情的加重，同时便秘也是部分药物治疗帕金森病的副作用之一[17]。

网络药理学是结合计算机科学、生物信息学和医学的综合学科，在“药物-靶点-疾病”相互作用的基础上，利用数据库进行网络分析，可以系统地分析药物对疾病的干预作用，揭示药物多分子协同作用于人体的机制，这与中医药复方治疗疾病多靶点有异曲同工之处，可以科学地分析中药复方对疾病的作用机制[18]。

网络药理学结果分析显示，白术-黄芪-枳实组方作用的靶点具有多样性，显示了中医“异病同治”的理论，同时也提示“扶土为先”理论的科学性，可从脾胃论治脑病。根据PPI 网络分析得出节点最多的MAPK8、IL-6 等靶点，结合文献确与帕金森病便秘存在相关性[19-22]。生物学功能GO 分析中，与白术-黄芪-枳实组方作用靶点生物过程相关联的有泛素样蛋白连接酶结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、DNA 结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性等，与帕金森病便秘的发展有相关性[23-25]。KEGG 信号通路分析得出，白术-黄芪-枳实组方作用靶点主要参与的信号通路有PI3KAkt、Hepatitis B、MAPK和neurodegeneration-multiple diseases 等，研究表明与帕金森病便秘相关[26]，同时也与脾胃疾病存在密切的关系[27]，由此也从信号通路说明了可通过“扶土为先”论治帕金森病便秘。MAPK和neurodegeneration-multiple diseases 信号通路也与帕金森病便秘密切相关[28-29]。Hepatitis B 信号通路与帕金森病便秘也存在高度相关，可能是其危险因素或共用信号通路[30]。

由于使用网络药理学研究中药对疾病的机制仍有其局限性，因此，本研究还通过动物实验进行验证。选取PPI 网络中关键节点，同时结合文献，选取MAPK8、IL-6、MYC 及Caspase3 基因及其蛋白表达量进行研究。本研究发现，MAPK8 是白术-黄芪-枳实组方治疗帕金森病便秘中的最主要节点，而动物实验结果也显示实验组结肠中MAPK8的基因表达量高于模型组，提示MAPK8 极可能为帕金森病便秘中的关键的基因，可将脑和肠联系起来。而实验组中IL-6、MYC 及Caspase3的基因表达量均低于模型组，与相关文献报道一致[8,31-32]。

文黛薇教授为第六批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师之一，行医数十载，一直重视脾胃，认为脾胃乃后天之本，化生之源，强调“调治百病、扶土为先”的学术思想，在内科疾病诊治方面逐步形成一套辩证思维方法和临床医疗经验。文黛薇教授指出，脾胃为“仓廪之官”“水谷之海”“后天之本”。所谓“本”，是指脾主运化，生血、统血，为气血生化之源，气机升降的枢纽，是保证生命活力的源泉。同时脑髓由水谷精微中至清至精者所化，所以文黛薇教授认为脾胃与脑关系密切，脑病的诸多症状，皆可从脾胃而论治。《伤寒论》中有提到“若大便坚，小便自利者，去桂加白术汤主之”，同时也有研究表明白术能促进肠道平滑肌蠕动，说明白术不仅可以益气健脾，同时也是治疗便秘的对症中药[33-34]。黄芪能补气健脾、益气固表，同时能通过调节肠道菌群来改善便秘的症状[35-36]。枳实具有调节胃肠动力、抗氧化、消炎镇痛等作用，多用于消化系统疾病的治疗。白术和黄芪“以补为通”，补虚而不壅滞，通腑而不伤正，同时结合枳实，辛散温通，破气消积，消补结合，一走一守，相互制约，相互为用，以达补而不滞，消而不散的功效。

本研究通过网络药理学对白术、黄芪、枳实的活性成分对帕金森病便秘的作用靶点和机制进行机制初步探讨，结果显示白术-黄芪-枳实组方治疗帕金森病便秘，作用靶点最主要的信号通路为MAPK8等，与“扶土为先”理论殊途同归，提示白术-黄芪-枳实组方可能通过健脾扶土治疗帕金森病便秘。