NLRP3基因单核苷酸多态性与慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果的关系

贾钦尧，宋珊，王涛，陈绍平

1川北医学院药学院，四川南充637000；2川北医学院附属医院呼吸与危重症科

支气管哮喘是一种以可逆性气流受限和气道高反应性为特征的慢性气道炎症性疾病，长期气道阻塞和炎症反应可引起阻塞性肺气肿、肺心病等，严重影响患者生活质量［1-3］。糖皮质激素是目前治疗支气管哮喘最有效的药物，但长期使用可引起机体一系列不良反应［4-5］。因此，临床医师一直在积极地寻找能够替代或辅助糖皮质激素的药物。阿奇霉素是第二代大环内酯类抗生素，能够通过抑制细菌蛋白的合成而发挥抗菌作用，可用于支气管哮喘的辅助治疗［6］。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）是体内固有免疫的重要受体。有研究报道，NLRP3炎症小体被激活后，可使无活性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，活化的Caspase-1能够将IL-1β、IL-18前体裂解为具有生物活性的IL-1β和IL-18，从而启动瀑布式炎症级联反应，加重支气管哮喘病情［7］。在临床治疗中发现，不同支气管哮喘患者相同方案的治疗效果差异显著。这可能与NLRP3基因单核苷酸多态性有关。本研究观察了NLRP3基因单核苷酸多态性与慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年1月—3月川北医学院附属医院收治的慢性持续期支气管哮喘患者180例。所有患者符合《中国支气管哮喘防治指南（基层版）》［8］中的诊断标准。纳入标准：①符合支气管哮喘诊断标准，临床分期为慢性持续期；②年龄18～65岁；③病程>1年；④接受阿奇霉素治疗且规律服药；⑤临床病历资料完整。排除标准：①因其他呼吸系统疾病引起的咳嗽、喘息等症状者；②合并造血系统、免疫系统、心血管系统、神经精神系统等疾病者；③合并心、肾、肝等重要脏器功能障碍者；④治疗依从性差者。所有患者在常规治疗基础上给予阿奇霉素治疗3个月，根据《中国支气管哮喘防治指南（基层版）》［8］中的哮喘控制测试（ACT）评分分为控制组（ACT评分≥19分）100例和未控制组（ACT评分<19分）80例。其中，控制组男54例、女46例，年龄20～64（52.79±7.47）岁，病程2～8（6.37±1.88）年；未控制组男45例、女35例，年龄22～61（53.54±7.31）岁，病程3～9（6.41±1.92）年。同期另选在川北医学院附属医院体检健康的志愿者100例（对照组），男51例、女49例，年龄25～60（52.92±7.14）岁。三组性别、年龄具有可比性，控制组与未控制组病程亦具有可比性。本研究经川北医学院附属医院医学伦理委员会批准（批准文号：202101040038），所有研究对象或其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 治疗方法 慢性持续期支气管哮喘患者根据具体病情，给予解痉、平喘、祛痰、扩张支气管等常规对症支持治疗，同时给予阿奇霉素口服，每次0.25 g，一周2次。当慢性持续期支气管哮喘患者最大呼气峰流速（PEF）或第1秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%）恢复至个人最佳值60%以上时，可出院回家继续治疗。连续治疗至少3个月。

1.3 NLRP3基因单核苷酸多态性检测 控制组与未控制组连续治疗3个月后末次随访时，对照组体检当日，征求研究对象或其家属同意后进行单核苷酸多态性检测。控制组、未控制组和对照组分别有90、75、92例同意参与检测。采集清晨空腹肘静脉血5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，-80℃超低温冰箱冻存。待标本成批后，提取全血基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外可见分光光度计鉴定，提取的基因组DNA纯度和浓度合格，可用于后续实验。借助SNP browser软件，选择NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648三个单核苷酸多态性位点，采用TaqMan探针法检测基因型。根据检测位点，设计PCR扩增引物和SNaPshot PCR延伸引物，并由广州擎科生物技术有限公司合成。按DNA扩增试剂盒说明配制反应体系，并借助荧光定量PCR仪进行DNA扩增。扩增条件：95℃10 min，95℃15 s、60℃1 min共40个循环。PCR扩增结束，借助SDS2.0软件采集反应信号，然后划分基因型。若仅存在1个荧光信号增强，则为纯合子；若存在2个荧光信号增强，则为杂合子。若荧光信号增强不明显，则需重复测定。

1.4 肺功能检测 慢性持续期支气管哮喘患者连续治疗3个月后末次随访时，于静息状态下，采用捷斯特CHESTGRAPHHI-10便携式肺功能仪检测FEV1%、第1秒用力呼气容积占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）、PEF。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料先行Shapiro-Wilk检验，确定符合正态分布后以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验。群体代表性分析采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三 组NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型分布比较 三组NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型的期望值和观测值符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。三组NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型比较差异均有统计学意义（P均<0.05），见表1。

表1 三组NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型分布比较（例）

2.2 NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型与慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果的关系 以阿奇霉素治疗后支气管哮喘是否控制（是=1，否=0）为 因 变 量，以NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位 点 基 因 型（GG=0，GC=1，CC=2）为自变量，纳入Logistic回归模型。结果发现，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点各基因型均为慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果的影响因素（P均<0.05），见表2。

表2 NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型对慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果影响的Logistic回归分析结果

2.3 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点不同基因型者肺功能比较 见表3～5。

表3 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs10754558位点不同基因型者肺功能比较（±s）

表3 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs10754558位点不同基因型者肺功能比较（±s）

注：与GG基因型比较，*P<0.05；与CG基因型比较，#P<0.05。

rs10754558位点基因型CC CG GG n 44 84 37 FEV1%（%）67.15±6.13*#60.23±7.25*54.76±6.43 FEV1/FVC（%）65.55±6.25*#61.62±6.43*56.56±6.38 PEF（L/min）385.72±31.57*#346.32±40.47*309.74±41.36

3 讨论

支气管哮喘是一种常见的气道慢性炎症性疾病。气道炎症几乎是所有类型支气管哮喘的共同特征，也是其临床症状和气道高反应性的基础。糖皮质激素是治疗支气管哮喘最常用、最有效的药物，其强效抗炎作用能够抑制气道炎症反应、降低气道高反应性。但在临床使用中发现，糖皮质激素的使用剂量个体差异较大，长期使用可引起机体一系列不良反应［4-5］。因此，治疗期间往往需要辅助用药。大环内酯类抗生素除了具有抑菌作用外，还具有降低气道高反应性、抑制炎症介质释放等作用。阿奇霉素是第二代大环内酯类抗生素，其在支气管扩张、肺囊性纤维化等疾病中的治疗效果已得到验证。REITER等［9］研究报道，支气管哮喘患者经大环内酯类抗生素治疗后，虽然FEV1较治疗前变化不明显，但能够明显改善PEF，降低气道高反应性，缓解临床症状。因此，大环内酯类抗生素有可能成为支气管哮喘的辅助治疗药物。张茂荣等［6］Meta分析发现，在常规治疗基础上使用阿奇霉素能够改善支气管哮喘患者FEV1、PEF，但仅能预防部分支气管哮喘患者急性发作，在减少支气管哮喘药物使用、改善临床症状方面效果并不明显。因此，阿奇霉素对支气管哮喘的治疗效果仍有待于进一步研究。

表4 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs10925019位点不同基因型者肺功能比较（±s）

表4 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs10925019位点不同基因型者肺功能比较（±s）

注：与GG基因型比较，*P<0.05；与CG基因型比较，#P<0.05。

rs10925019位点基因型CC CG GG n 80 62 23 FEV1%（%）64.12±6.46*#61.64±6.24*55.38±6.72 FEV1/FVC（%）63.52±5.69*#60.78±6.41*57.89±6.48 PEF（L/min）378.48±38.26*#352.36±42.17*312.34±33.12

表5 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs4925648位点不同基因型者肺功能比较（±s）

表5 慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs4925648位点不同基因型者肺功能比较（±s）

注：与GG基因型比较，*P<0.05；与CG基因型比较，#P<0.05。

rs4925648位点基因型CC CG GG n 117 42 6 FEV1%（%）61.25±6.63*60.22±7.41*53.14±6.68 FEV1/FVC（%）63.55±6.45*#59.63±6.42*54.47±6.32 PEF（L/min）369.74±33.75*#332.35±42.85*294.54±36.15

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型代表，主要由C端亮氨酸重复序列、N端热蛋白结构域和中间的NACHT结构域三部分组成，通过亮氨酸重复序列识别三磷酸腺苷、内毒素、胞壁酰二肽等信号分子，使其构象发生变化，同时其N端热蛋白结构域通过募集凋亡相关斑点样蛋白、Caspase-1，最终形成NLRP3炎症小体，进而引起机体异常炎症反应［10-11］。NLRP3炎性小体异常激活已被证实与慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肺纤维化等炎症性疾病密切相关［12-13］。有证据表明，NLRP3炎性小体在支气管哮喘气道炎症反应中发挥重要作用［14］。急性发作期支气管哮喘患者肺组织NLRP3 mRNA表达高于慢性持续期，经有效治疗后NLRP3 mRNA表达可明显降低。因此，NLRP3 mRNA表达能够反映支气管哮喘严重程度和治疗效果［13］。

本研究选择NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648三个单核苷酸多态性位点［13，15］，并对控制组、未控制组和对照组这三个单核苷酸多态性位点的基因型进行分析，结果发现三个位点基因型的期望值和观测值具有可比性，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明研究对象具有群体代表性。本研究结果发现，控制组、未控制组和对 照 组NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型比较差异均有统计学意义，提示NLRP3基因单核苷酸多态性与慢性持续期支气管哮喘发生有关。Logistic回归分析发现，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点各基因型均为慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果的影响因素，证实NLRP3基因单核苷酸多态性与阿奇霉素治疗慢性持续期支气管哮喘的临床效果有关。进一步研究发现，慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点不同基因型者FEV1%、FEV1/FVC、PEF比较差异均有统计学意义。其中，慢性持续期支气管哮喘患者NLRP3基因三个位点纯合子CC基因型者FEV1%、FEV1/FVC、PEF水平最佳。提示NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点基因型与慢性持续期支气管哮喘患者的肺功能关系密切。胡向阳等［16］研究报道，冠状动脉粥样硬化患者NLRP3基因rs10754558位点GG、GC基因型者血清ET-1、E选择素水平明显高于CC基因型者，而血清NO水平明显低于CC基因型者，表明GG、GC基因型可能通过激活炎症反应而促进疾病进展。由此推测，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点GG或GC基因型能够激活NLRP3炎性小体，促进炎症因子释放，通过激活炎症反应而促进支气管哮喘病情进展，继而影响阿奇霉素的治疗效果。但对于NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点影响慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素治疗效果的具体机制还需要进一步探索。

综上所述，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点单核苷酸多态性与慢性持续期支气管哮喘阿奇霉素的治疗效果密切相关；NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位点纯合子CC基因型越多，阿奇霉素的治疗效果越好。