固相萃取-超高效液相色谱法测定土壤中土霉素、四环素及金霉素

邓宇，乌仁图雅，李宝栋，李雯雯，荣迪，娜日娜，陈琪，赵剑平，正月，倪林俊，王岩

（1.赤峰市农牧科学研究所，内蒙古赤峰 024000； 2.赤峰市动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰 024000）

四环素类药物是最常见的兽用抗生素之一。随着畜牧业集约化、规模化养殖模式的发展，抗生素开始广泛应用于畜禽养殖业，不仅用于治疗和预防动物传染性疾病，还以亚治疗剂量添加于畜禽饲料中用于刺激动物生长和促进增产［1］。因抗生素价格低廉且能产生较高的经济效益，使得畜禽养殖业中存在违规滥用大剂量抗生素行为。畜禽摄入的抗生素有30%～90%以原药或代谢产物的形式排出体外［2］，残留在畜禽粪便中的抗生素最终通过径流和渗透作用进入地表水和地下水中，对环境和人体健康构成潜在威胁［1，3］。目前，有较多文献报道粪便、土壤、水体等环境介质中存在较高浓度的抗生素［4–5］，其中，四环素类抗生素最为普遍［6–7］。研究表明，难降解、易吸附的四环素类抗生素可通过食物链传输，尤其是含四环素的人畜粪便作为有机肥料施用于农田时，可能导致抗生素随食物链积累的风险［8］。

环境中四环素类抗生素残留检测的研究近年来受到了国内外更多的重视［9–12］。因环境介质中存在种类繁多的抗生素污染物，且存在含量较低、基体复杂等特点，建立一种准确度高、快速有效的分析方法成为研究的重点。

笔者对土壤中土霉素、四环素和金霉素3种抗生素的萃取方法进行优化，并选取最佳流动相组成和洗脱程序，以超高效液相色谱法测定，有效地降低了测定过程中土壤样品的基质效应。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Agilent1290型，配VWD紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司。

台式冷冻离心机：Multifuge X3R型，美国赛默飞世尔科技公司。

恒温水浴振荡器：SHY–A型，金坛市成辉仪器厂。

固相萃取仪：W–SPE24型，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

氮吹仪：912b型，美国Organomation 公司。

土霉素、四环素、金霉素标准物质：纯度（质量分数）分别不小于96.5%、94.2%、99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国瑞米克公司。

磷 酸 氢 二 钠–柠 檬 酸 缓 冲 液：pH值 为6.8±0.05，将1 000 mL 0.4 mol／L磷酸氢二钠溶液与294 mL 0.2 mol／L 柠檬酸溶液混匀。

甲醇–水溶液（5+95）：量取5 mL 甲醇与95 mL 水混匀。

草酸–甲醇溶液：0.01 mol／L，称取1.30 g 草酸（C2H2O4·2H2O），用甲醇溶解，定容至1 000 mL。

乙腈–甲醇混合溶液：乙腈与甲醇体积比为1∶1的混合溶液。

实验所用其它试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取一定质量的土霉素、四环素、金霉素标准物质，分别用甲醇溶解、稀释和定容，配制成2 mg／mL标准储备溶液，于0～4 ℃保存。

分别吸取5.0 mL土霉素、四环素、金霉素标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，混匀，各组分的质量浓度均为100 μg／mL，该混合标准溶液于4 ℃保存，然后按需求稀释成不同的浓度。

1.2.2 Na2EDTA–Mcllvaine –甲醇提取液

称取37.22 g Na2EDTA·2H2O，用水溶解，定容至1 000 mL，与磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液及甲醇按体积比1∶1∶2混匀，用NaOH溶液或HCl溶液调节pH值为7.20±0.05。

1.2.3 样品采集

土壤样品采集后去除杂质，在室温条件下自然风干，粉碎，过0.25 mm筛，密封，于–18 ℃冷冻保存。

1.2.4 样品处理

抗生素提取：称取过筛样品1.0～2.0 g（精确至0.1 g）于50 mL离心管中，加入20 mL Na2EDTA–Mcllvaine–甲醇提取液，振荡20 min，以3 500 r／min转速离心10 min，重复提取两次，合并上清液并定容至50 mL。

固相萃取：萃取柱用5 mL甲醇及5 mL水活化。取上述上清液5 mL，以1.0 mL／min流量过HLB柱，用5 mL甲醇–水溶液（5+95）淋洗固相萃取柱，真空抽干后用5 mL草酸–甲醇溶液洗脱，于40 ℃下氮吹浓缩至体积小于0.5 mL，用2 mL草酸–甲醇溶液溶解残渣，过0.22 μm滤膜后进样测定。

1.2.5 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，4.6 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL；检测波长：355 nm。流动相及梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相及梯度洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 流动相的选择

用于高效液相色谱流动相的水相通常使用缓冲溶液，例如0.01 mol／L 的草酸溶液，草酸能与金属离子螯合，有效消除金属离子对四环素类抗生素分析的干扰。甲醇是最常见的有机溶剂且在紫外波段吸收较低。乙腈洗脱能力较强，其在紫外波段的吸收低于甲醇，且在相同流量下不会增大色谱柱压，因而被广泛采用［13］。因此，本实验采用乙腈–甲醇溶液和0.01 mol／L 的草酸溶液作为流动相。

调整流动相中水相与有机相的比例进行试验，当0.01 mol／L的草酸溶液与乙腈–甲醇溶液的体积比为65∶35时，总分析时间大幅缩短，但土霉素与四环素的分离度较低，影响准确定量。最终选择乙腈–甲醇溶液（体积比为1∶1）与0.01 mol／L草酸水溶液的体积比为16∶84，采用表1梯度洗脱程序，分离效果最佳，3种四环素类抗生素混合标准溶液的色谱图如图1所示。由图1可知，3种四环素类抗生素在32 min内可实现较好的分离，色谱峰峰形尖锐，有良好的对称性，适于准确定量。

图1 土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液色谱图

2.1.2 检测波长选择

通过VWD紫外检测器检测扫描，分析3种四环素类抗生素的光谱，发现各物质在250～480 nm内有较强的紫外吸收。为了兼顾各抗生素均有较高的灵敏度，选择355 nm 为吸收波长［14–15］。

2.2 线性方程及检出限

配制系列混合标准工作溶液，在1.2.5色谱条件下进行测定，以各抗生素质量浓度X（µg／mL）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归，计算线性方程和相关系数，线性范围、线性方程、相关系数列于表2。由表2可知，各抗生素质量浓度在0.1～20.0 µg／mL范围内与色谱峰面积线性良好，相关系数均大于0.999 6。

表2 相关系数、标准曲线线性方程及线性范围

将不同浓度水平的标准溶液，分别加入到空白土壤样品中，用本方法进行测定，每个水平重复检测11次，按照文献［16］计算方法检出限和定量限，所得结果列于表3。由表3可知，本方法3种抗生素的检出限分别为0.54、0.66、0.83 mg／kg。

表3 方法检出限和定量限

2.3 加标回收试验

分别选择土壤样品A、B、C，按照1.2.4方法处理，在1.2.5色谱条件下进样分析，结果均未检测出土霉素、四环素、金霉素。向土壤样品中分别添加16.7、100、500 mg／kg 3个浓度水平的土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液，重新处理并测定6次，加标样品色谱图如图2所示，计算测定结果的相对标准偏差和加标回收率，结果列于表4。

图2 加标土壤样品色谱图

表4 3种抗生素的回收率和相对标准偏差（n=6） %

由图2可知，土壤样品中3种四环素类抗生素分离良好，土壤基质无干扰。由表4可知，3种四环素类抗生素测定结果的相对标准偏差为0.75%～4.99%（n=6），样品的加标回收率为71.7%～ 97.3%，表明本方法具有良好的精密度，且准确度较高，能满足样品分析要求。

3 结语

采用固相萃取处理样品，建立了超高效液相色谱法测定土壤中土霉素、四环素和金霉素3种四环素类抗生素的检测方法。样品使用Na2EDTA–Mcllvaine –甲醇提取液，以HLB固相萃取柱净化。该方法重现性好，准确度高，对实现土壤中四环素类抗生素残留监控具有重要的意义。