核磁共振波谱法分析代县黄酒成分及酒龄

李刚，张松，高碧霞，赵智勇，赵晶晶

（1.山西省科技资源与大型仪器开放共享中心，太原 030012； 2.山西省饲料兽药监察所，太原 030027）

黄酒是世界上三大古酒（啤酒、葡萄酒、黄酒）之一［1］，具有活血祛寒、温经通络、健身强体、延年益寿之功效，是中药丸散膏丹的重要辅料。陈酿是黄酒生产工艺中重要的过程之一，黄酒的陈酿时间也称为酒龄，是评价黄酒品质优劣的重要指标［2］。早在宋代酒业专著《酒名记》中就有“代州金波又琼酥”的记载，“金波”即指代州黄酒［3］。代县黄酒以当地特有农作物黍米为原料酿制而成，其独特的酿造技术成功入选山西非物质文化遗产保护名录。黄酒的营养丰富，含有大量的氨基酸、碳水化合物、有机酸、酯类物质及矿物质元素等［4］。目前市售代县黄酒有不同的酿制年限，包括5年、8年、10年、20年等。

黄酒成分检测通常采用气相色谱、液相色谱等方法，这些方法样品处理过程复杂，标准品昂贵，实验条件难摸索，检测过程耗时长。1H NMR技术具有无破坏性、无偏向性及快速测定的优势，以组群指标分析为基础，以高通量检测和多元数据分析处理为手段，具有整体观的研究思路［5–6］，已应用于酒科学相关研究［7］，如Gougeon［8］等应用1H NMR技术分析了法国6个不同主产区的红酒，表明Bordeaux红酒与其它5个地区红酒差异显著；Hu等［9］采用1H NMR技术分析了夏敦埃白酒不同放置年限的差异。笔者基于1H NMR技术，指认出代县黄酒的30种主要成分，研究了不同酒龄的代县黄酒化学成分的差异特征及成分稳定性，为代县黄酒在品质提高、生产工艺优化及质量改进等方面提供了科学依据。

1 实验方法

1.1 主要仪器与试剂

核磁共振波谱仪：AVANCEⅢ型，600 MHz，配5 mm核磁管，德国布鲁克公司。

超声波清洗仪：KQ–250DE型，东莞市科桥超声波设备有限公司。

重水：25 mL，批号为174611，北京百灵威科技有限公司。

氘代三甲基硅烷丙酸钠盐（TSP）：单位装量为1 g，批号为226597，北京百灵威科技有限公司。

氘代氢氧化钠：10 mL，批号为551792，北京百灵威科技有限公司。

氘代甲醇：25 mL，批号为184886，北京百灵威科技有限公司。

乙酸乙酯：分析纯。

代县黄酒样品：酒龄分别为5、8、10、20年，山西省代县贵喜酒业有限公司。

1.2 样品制备

取5 mL黄酒样品于蒸发皿中，置于70 ℃恒温水浴锅中，直接蒸干，得残渣M1。称取适量残渣，加入氘代甲醇400 μL与缓冲重水（将NaH2PO4溶于含0.1% TSP的重水中，以氘代氢氧化钠溶液调节pH至6.0）400 μL溶解，溶解液转移至1.5 mL离心管中，以转速13 000 r／min离心10 min，移取上清液600 μL于核磁管中，待测。

用量筒量取75 mL代县黄酒样品于分液漏斗中，按照体积比1∶1加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液蒸干，得到黄酒乙酸乙酯层（M2）。称取适量残渣，采用700 μL氘代甲醇溶解。将溶解液分别转移至1.5 mL离心管中，以转速13 000 r／min离心10 min，移取上清液600 μL置于核磁管中，待测。

1.3 1H NMR样本测试

样品在25 ℃下于600 MHz NMR仪上测定（频率为600.13 MHz），扫描次数为64，脉冲宽度为12.6 μs，谱宽为12 345.7，数据点大小为65 536，采用noesypprld序列压制水峰，zg30序列压制甲醇峰。

1.4 数据处理与分析

核磁图谱采用MestReNova软件（Version 8.0.1，西班牙mestrelab research公司）进行处理，经过定标、相位、基线校准后，以δ0.01×10–6积分段对化学位移区间进行分段积分。在M1核磁图谱中对化学位移δ(0.60～9.60)×10–6进行分段积分，其中δ(4.80～5.10)×10–6（残余水峰）和δ(3.28～3.36)×10–6（残余甲醇峰）不进行积分；在M2核磁图谱中对化学位移δ(0.60～10.00)×10–6进行分段积分，其中δ(3.28～3.36)×10–6（残余甲醇峰）不进行积分。

将积分数据进行归一化后导入Excel 中，采用SIMCA–P 14.0（瑞 典Umetrics公 司）软 件 进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判别分析（PLS–DA）。对1H NMR图谱中信号未完全重叠的物质利用积分面积进行单变量分析，并将数据导入Graphpad Prism 6.01软件（美国GraphPad公司）中制作折线图。

2 结果与讨论

2.1 1H NMR图谱峰的指认与归属

黄酒中含有不同极性的化合物，为全面表征其化学成分，对代县黄酒样品采用直接蒸干和用乙酸乙酯萃取两种方式进行处理。直接蒸干的黄酒M1的1H NMR图谱如图1（A）所示，该图谱大致可分为3个区域，高场区δ(0.50～3.00)×10–6为氨基酸和有机酸区，δ(3.00～5.50)×10–6为糖区，δ(5.50～9.60)×10–6为芳香区。对黄酒进行乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯层M2，其1H NMR图谱如图1（B）所示。分析图1（B）可知乙酸乙酯层含有大量的醇类、醛类及酯类化合物。通过分析化学位移、耦合常数、峰形等图谱信息，结合HMDB及BMRB数据库，并参照文献［10–12］，在黄酒样本中共指认出30种化合物，包括氨基酸11种，有机酸9种，糖类4种，醇类3种及其它3种，结果列于表1。

表1 代县黄酒中主要成分的1H NMR信号归属

图1 代县黄酒样本典型的600 MHz 1H NMR图谱、

2.2 多元统计分析

黄酒酿制技术独特，化学组成复杂，所得的1H NMR图谱中涵盖了大量的化学指纹信息，直观分析难以显示不同酒龄的黄酒化学成分差异，需要进一步采用多元统计方法进行比较分析。

主成分分析（PCA）是在保留原始变量主要信息的前提下，通过降维把许多具有一定相关性的指标约化为少数几个综合指标来代替原来指标的多元统计分析方法。随着主成分的增加，其所包含的信息量越来越少［13–14］。PCA得分散点图能直观地显示不同样品之间的固有差异，通过对不同酒龄的黄酒样本进行分析，由主成分1（PC1：29.2%）和主成分2（PC2：18.1%）构成M1的得分图［图2（A）］、由主成分1（PC1：39.4%）和主成分2（PC2：12.1%）构成M2的得分图［图2（B）］均显示，不同酒龄的黄酒样品化学成分存在明显差异。不同酒龄代县黄酒成分含量分布如图3。为了区分不同酒龄黄酒之间的明显差异特征，将不同酒龄代县黄酒含量最高和最低成分列于表2。利用PCA散点图，结合含量特征，可以初步判别代县黄酒的酒龄。

表2 不同酒龄代县黄酒特征成分

图2 不同酒龄代县黄酒样品1H NMR图谱的PCA散点图

图3 不同酒龄代县黄酒样品成分含量分布

利用以下方法进行验证：抽取某未知酒龄的代县黄酒，进行核磁实验，得到1H NMR图谱，做PCA得分散点图，该黄酒样品落在20年区域。计算该未知黄酒成分相对含量，结合前实验中已有的含量分布图，发现谷氨酸，谷氨酰胺，酪氨酸等含量最高，异戊醇含量最低，可判定该样品为20年酒龄的代县黄酒。通过实验，验证该方法有一定可行性，具有前处理简单、可快速判别的特点。

不同酒龄黄酒的成分含量较为复杂，因此，对黄酒成分再进行Heatmap分析，结果如图4。由聚类情况可以看出：20年黄酒聚为一类，5年、8年、10年黄酒大部分样品聚为一类，少数样品发生漂移，与上述PCA散点图分布相似。实验结果表明：20年黄酒成分稳定，质量控制较好。5年、8年、10年成分相对稳定，但有少量样品漂移，质量控制水平可进一步提高。

图4 不同酒龄黄酒样品1H NMR图谱指认化合物的Heatmap图

进一步对黄酒样品成分进行Pearson相关分析，结果如图5所示。由图5可知，5-HMF与α-葡萄糖含量呈显著负相关，可能与发酵过程中葡萄糖的美德拉反应有关［15］；乙酸与乙酸乙酯含量呈显著负相关，可能与乙酸发生酯化反应有关；谷氨酸与谷氨酰胺呈显著正相关，二者与苯丙氨酸呈显著负相关；苏氨酸与丁香酸呈显著负相关等。以上相关性分析结果，为阐明代县黄酒酿制机理，优化营养成分提供了理论依据。

图5 不同酒龄黄酒样品1H NMR图谱指认化合物的Pearson相关分析图

3 结论

（1）首先通过1HNMR实验，得到代县黄酒1H NMR图谱，分析指认出其含有氨基酸、有机酸、碳水化合物、醇类、醛类等30种化学成分。

（2）其次运用多元统计分析方法，PCA散点图显示：20年黄酒样品聚为一类；5年、8年、10年样品聚类大致可以分开，有少量重叠；样品含量分布图显示：不同酒龄黄酒成分含量具有明显特征，以上说明不同酒龄黄酒样品化学成分含量存在明显差异。通过PCA散点图和成分含量特征，可判别未知代县黄酒酒龄。

（3）对样品进一步采用Heatmap分析，结果表明：20年黄酒成分稳定，质量控制较好；5年、8年、10年成分相对稳定，质量控制可进一步改进。

（4）最后利用Pearson相关分析，找出代县黄酒成分之间的相关性，为优化黄酒营养成分奠定了基础。

以上研究可为代县黄酒改进生产工艺、优化营养成分及提高其品质提供科学依据。