伽马射线辐照对血小板贮存损伤的影响*

刘奇 王世春 姚春艳

血液辐照是采用射线对全血及成分血进行照射，利用电离辐射直接损伤具有免疫活性的T淋巴细胞或其他目标细胞中的DNA，进而减少输血不良反应的发生[1]。研究发现利用血液辐照技术可以有效的对塞卡病毒、朊病毒、埃博拉病毒、新型冠状病毒进行灭活，是有效阻断病毒传播的方式[2]。伽马射线辐照是最常见的血液辐照方法，对血小板来说，辐照剂量通常为25～30 Gy，可以有效减少血小板病原体污染，预防血小板输血相关的移植物抗宿主病，伽马射线辐照是灭活血小板中残留的其他免疫细胞及病毒污染简便快捷的方法[3]。

早期研究表明伽马射线辐照不会对血小板功能造成明显的损伤[4]，但是近年来随着检测手段的进步及检测指标的日益完善[5]，发现伽马射线辐照对血小板贮存损伤有一定的影响（见图1），血小板贮存损伤（PSL）是指血小板在体外保存过程中，血小板的结构和功能发生的一系列改变，这些变化的总和被概括为血小板贮存损伤[6]。血小板贮存损伤主要表现为以下几个方面：首先是在保存过程中由于新陈代谢产生的乳酸及活性氧（ROS）积累在细胞内，导致pH值下降、糖酵解增加、线粒体功能紊乱；其次血小板细胞膜的去极化导致血小板凋亡增加、膜上许多关键性的功能蛋白提前活化、膜表面颗粒大量释放脱落；最后一个方面是血小板形态由圆盘状变为球状，致使其粘附及聚集功能下降[7]。这些改变对血小板输注后在患者体内的存活率和止血功能有巨大影响。本文就伽马辐照对血小板的蛋白组学、氧化应激、病原体灭活及输注疗效作一简短回顾。

图1 伽马射线辐照引起血小板贮存损伤的机制图

1 伽马射线辐照对血小板蛋白组学的影响 血小板蛋白质对血小板发挥止血功能有重要的作用，目前已鉴定出4 000余种血小板蛋白质，它们属于各种亚蛋白组，对血小板生成及功能有重要影响[8]，明确伽马辐照对血小板蛋白组学的改变具有重要意义。THIELE等[9]采用SDS-PAGE分离、液相色谱串联质谱LC-ESI-MS/MS蛋白组学技术，比较伽马射线辐照的血小板（辐照剂量30 Gy）、紫外线照射的血小板（照射剂量（3.9±0.1）J/cm2）以及正常保存的血小板的相关蛋白质谱变化，总共鉴定了948种蛋白质，其中721种是多肽类蛋白质。结果显示在保存第1天，与正常保存对照组相比：伽马辐照引起49种蛋白质发生变化，紫外照射引起23种蛋白质发生改变。各组保存5天后，与对照组第一天相比：紫外照射处理引起58种、伽马射线辐照处理引起50种、对照组本身36种蛋白发生变化。进一步基因分析显示许多蛋白质的催化活性以及蛋白质与核酸的结合能力受到影响。研究结果表明伽马射线辐照在第1天引起的蛋白组学变化强于紫外线照射，但在第5天紫外照射处理会导致血小板蛋白损伤增加，总的来说伽马射线辐照相对紫外照射来说对血小板蛋白贮存损伤的影响相对较小。

伽马射线辐照对血小板的蛋白质组学的负面影响已有报道[10]。伽马射线辐照血小板后显示血小板细胞骨架蛋白水平的改变，如肌动蛋白随着保存时间的延长而降低。伽玛射线辐照后第1天显示蛋白酶体激活剂复合体亚基1亚型2（PACS1I2）的水平较高，该复合体参与DNA损伤修复，调节血小板的细胞形态和细胞骨架重排。伽马射线辐照可以影响二硫键异构酶（ERP72）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）、胆碱转运蛋白2（SLC44A2）、肌球蛋白α1链（TPM1）、Septin-11、Parvalbumin α等蛋白的活性，进而影响血小板聚集、细胞骨架重排和血小板氧化效应等细胞功能。Rho蛋白是一类相对分子质量为20～25 KD的三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白，又被称为Rho GTP酶，Rho蛋白及其调控分子在血小板细胞骨架重排方面发挥了至关重要的调控作用，参与了血小板收缩、血小板伪足形成以及血小板颗粒分泌等重要过程[11]。伽马射线辐照后可以降低血小板Rho二磷酸鸟苷（GDP）解离抑制因子1的相对浓度，它们通过抑制GDP的解离和随后的GTP与Rho蛋白的结合来调节大多数Rho蛋白的GDP/GTP交换反应。

伽马辐照可以提高Ras相关蛋白Rap-1b亚型1（Rasrelated protein Rap-1b isoform 1）的表达，该蛋白位于G蛋白偶联受体（GPCRs）的下游和血小板整合素αⅡbβ3的上游，对血小板的止血功能至关重要[12]。类似地，伽马辐照可以提高钙调蛋白的表达，表明伽马辐照后可以影响血小板对激动剂的反应能力[13]。还发现其他蛋白质在伽马辐照后的血小板中表达上调，例如肿瘤蛋白翻译控制1（TPT1），它可能在血小板的激活中起作用，因为它是一种钙结合蛋白，参与维持细胞微管的稳定[14]。

2 伽马射线辐照对血小板氧化应激的影响 活性氧能够调控血小板活化、聚集、诱导血小板凋亡，是生物体内氧化反应过程中形成的氧自由基，低浓度的活性氧是细胞生长、生存、信号转导等所必需的胞内信号分子，过量的活性氧会导致氧化应激并引起蛋白质、脂质和DNA发生氧化损伤[15]。活性氧可以通过不同的途径激活血小板，被认为是血小板贮存损伤的标志之一[16]，血小板产生活性氧有两个重要的来源，包括通过激活NAPDH（腺嘌呤二核苷酸磷酸）等氧化酶产生的胞浆活性氧和线粒体呼吸作用等生成的活性氧。

研究发现伽马射线辐照使血小板中残留的T淋巴细胞失活的同时也会通过不同的机制电离辐射产生活性氧，对血小板的贮存损伤有一定的影响[17]。血小板在正常保存过程中，活性氧和乳酸盐脱氢酶呈时间依赖型缓慢增高，而谷胱甘肽过氧化物酶和葡萄糖呈时间依赖型逐渐减少。然而NODEH[18]等研究发现伽马射线辐照当天会加速线粒体产生活性氧，致使血小板内活性氧（H2O2、超氧阴离子）的水平明显提高，之后活性氧逐渐回调至正常水平，但保存后期活性氧又显著提高。血小板胞内的谷胱甘肽过氧化物酶水平及上清液中还原型谷胱甘肽的含量在伽马射线辐照当天显著降低，而乳酸脱氢酶在胞内的表达下调而上清液中的活性却在伽马射线辐照后提高，说明伽马射线辐照加速了血小板的新陈代谢，增强了氧化应激。分析原因作者认为早期活性氧浓度的增加是伽马辐照的直接效应，而后续回调至正常水平可能是以消耗血小板内与活性氧清除相关的酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶）为代价获取的。后期积累的活性氧造成细胞损伤诱导乳酸脱氢酶的释放，加剧氧化应激的改变，进一步造成血小板贮存损伤。

抗氧化酶蛋白（DJ-1）在血小板氧化应激反应中起主要作用，DJ-1在伽马射线辐照后过表达。伽马射线辐照后诱导血小板氧化应激标志物硫醇异构酶（ER-60蛋白酶：催化和协调基于氧化还原蛋白质的二硫键修饰，从而调节血小板功能）的表达显著下调[19]。通过多反应监测质谱法分析上清液中与氧化应激相关代谢物，结果证实经伽马辐照处理的血小板上清培养液中的代谢率和氧化应激产物增加，此项研究表明伽马射线辐照可能会加速由于氧化应激引起的血小板衰老[20]。

血小板中线粒体通过电子链传递（ETC）过程中的氧化磷酸化合成三磷酸腺苷（ATP），在这个过程中，由于ETC泄漏的电子对氧分子（O2）进行单电子还原而产生超氧阴离子（O2–）[21]。研究表明[22]，在细胞暴露于电离辐射后，线粒体产生的活性氧会导致基因组的不稳定。当细胞暴露于5 Gy伽马射线辐照后，发现辐照后细胞发生明显的下列氧化应激时间序列变化：在辐照后几分钟内细胞内活性氧水平快速增加，但在30分钟后活性氧水平逐渐恢复正常，辐照后12小时检测到线粒体功能障碍，线粒体电子传递链中调节活性氧释放的最重要的NADH脱氢酶的活性降低，辐照24小时以后，线粒体产生ROS的能力明显升高，线粒体DNA氧化明显增强。辐照后线粒体功能障碍导致的持续氧化应激，可能会加速促进辐照诱导的基因组不稳定。通过给予抗氧化剂使线粒体功能正常化可能是减缓辐照引起的血小板氧化应激、延长血小板保存时间的一种潜在策略。

3 伽马射线辐照对血小板残留免疫细胞及细胞因子灭活的影响 发热性非溶血性反应（NHFTRs）是输血相关的常见不良反应[23]，大量研究表明，血小板保存过程中会分泌细胞因子，如白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，血小板中细胞因子水平的升高与发热性非溶血性输血反应有关。血小板中细胞因子的来源被认为是受污染的白细胞，特别是单核细胞所产生，因此减少或使血小板中残留的污染细胞失活是防止细胞因子产生一种重要举措。

研究表明[24]伽马射线辐照可以使血小板中受污染的淋巴细胞、部分白细胞失活，从而减少转化生长因子-β1（TGF-β1）、血小板第四因子（PF4）等细胞因子及趋化因子在血小板保存过程中的产生和积累。在血小板保存过程期间产生的细胞因子中，IL-8是一种重要炎症介质，当机体受到感染及某些自身免疫性疾病的影响时，由具有Toll样受体的细胞分泌，并在炎症局部、血清和体液中显著增加。但对于伽马射线辐照血小板后对IL-8的合成与分泌存在一定争议，POURFATHOLLAH等[25]研究表明经辐照和未辐照的血小板在保存过程中IL-8浓度均有不同程度的升高，但两者差异无统计学意义，而VOLL[26]研究却表明在保存5天后，伽马射线辐照血小板后会抑制p选择素（CD62p）的表达以及IL-1b和IL-8的分泌。

此外研究发现经伽马射线照射的外周血单个核细胞（PBMNCs）产生的细胞因子数量与未经处理的白细胞产生的细胞因子数量没有显著差异[24]。对术中回收的自体血进行伽马射线辐照，并对辐照前后血中的促炎介质、肿瘤坏死因子、白介素21β、嗜酸性粒细胞趋化蛋白和单核细胞趋化蛋白进行检测，结果发现，上述物质并没有因为辐照而升高。而且经辐照的自体血回输后，患者体内上述物质的含量很少，较输注前未明显上调，从而不会导致免疫炎性反应[27]。

总的来说笔者认为伽马射线辐照在血小板保存过程中通过抑制细胞因子合成与分泌的途径从而来减缓免疫反应的效果有限，尽管伽马射线辐照可以使T淋巴细胞等失活使其不能够再增殖，可以减少由少量白细胞介导的免疫反应，但不能消除和阻止细胞因子的合成和分泌，甚至有可能产生与未经处理的细胞同等的细胞因子数量。此外FAST和HEDDLE等[24，28]研究发现在未经刺激、未经处理或伽马辐照的细胞上清液中检测到IL-6的水平有可能足以潜在的引发输血不良反应。

为了有效防止保存过程中血小板中细胞因子的产生和积累，应该使用其他的方法，比如保存前过滤去掉相关免疫细胞，如白细胞去除术。此外以核黄素加入血浆或血小板制品在紫外线作用下对核酸进行靶向修饰从而灭活病毒、细菌、寄生虫等病原微生物的去除技术[29]，可以导致病原微生物核酸的不可逆性损伤，阻止其增殖，也可通过该机制灭活包括淋巴细胞在内的白细胞，从而有效抑制免疫细胞因子的合成和分泌，但此种方法可能会增加血小板的贮存损伤。

4 伽马射线辐照对血小板输注疗效的影响 ZHU等[30，31]研究评估和比较了伽马辐照机采血小板和非辐照机采血小板在化疗引起的血小板减少症患者中的止血功能、输血效果和安全性。结果显示伽马辐照后对保存期间的血小板计数、平均体积（MPV）、平均分布宽度（PDW）、pH值、血小板低渗休克反应、血小板形态及相关的凝血参数均无显著影响，在输血后1小时和24小时的病人的止血相关的功能参数（最大振幅：MA，反应时间：R、Angle角）、输血后24小时的CCI（血小板输注后增高指数）均无统计学差异（P＞0.05）。两组均无关于出血、不良事件和急性输血反应的事件发生。总的来说伽马射线辐照血小板后对血小板的止血功能，输血效率均无明显影响，但为保证最好的治疗效果，建议不论是普通血小板制品还是辐照血小板制品，均应尽早输注到患者体内。伽玛射线辐照血小板在常规使用中是安全的，即使是对于免疫功能严重受损或接受过干细胞移植的高危患者也是如此，输注伽马辐照机采血小板能够在一定程度上降低患者的体液免疫反应。

但是上述研究同时表明，输注保存0～3天的伽马射线辐照的血小板，输血后1小时CCI及24小时的平均CCI比输注非辐照的血小板组都低（辐照vs非辐照，1 h：11.59±5.97 vs 12.83±6.33；24 h：5.76±4.05 vs 6.56±4.10），即使这一差异并无统计学意义，但提示伽马辐照血小板可能会增加血小板的贮存损伤，导致血小板的输注疗效和CCI降低。此外也有研究表明[32，33]，未辐照的血小板产生更高的CCI，随着辐照后保存时间的延长，伽马射线辐照对CCI的负面影响可能会更加明显。JULMY等[33]在单变量分析中，预先辐照的血小板的输血效率为27.7%，而输注当天辐照的血小板的输血效率为35.0%，研究表明当天辐照的单采血小板输注效果明显优于预先辐照的血小板的输注效果，两者存在统计学差异。目前各种指南规定，血小板浓缩物的辐照可以在保存过程中的任何阶段进行[3，34]，但实际上目前有相关研究结果[33]更支持血小板应该在输血前接受血液辐照并至少在辐照后24小时内进行输注为最佳，以减少辐照引起的贮存损伤对血小板输注疗效的影响。

5 总结展望 伽马辐照可以消除血小板中残留的白细胞对有丝分裂原的反应能力及抑制同种异基因T淋巴细胞分化的能力[35]，因而可以预防HLA抗原同种免疫反应及TA-GVHD。血液制品的最佳辐照剂量[1]应以既能灭活淋巴细胞又能维持其他血液成分的功能与活力以及最小的损伤为选择，何其通等[36]探讨不同剂量辐照后淋巴细胞的灭活和对血小板功能的影响，发现剂量达到35 Gy时，对淋巴细胞的灭活效果显著且对血小板的临床止血效果没有明显影响，但过高剂量的伽马射线辐照或者辐照后保存时间过久[18]，均会对血小板的贮存损伤造成影响，目前已经明确的机制有：伽马射线辐照可以通过诱导H2O和O2等方式产生活性氧，破坏血小板内氧化还原平衡，造成氧化应激致使线粒体功能受损，血小板蛋白组学发生改变，基因发生氧化损伤。

辐照对血小板的产品质量有一定的影响，因此对于不同类型的病人是否需要接受辐照血小板输注这一关键问题，2020年8月英国血液病学学会（BSH）发布了辐照成分血的应用指南[37]，对于有先天性T细胞免疫缺陷或确诊之前的新生儿和婴儿，必须接受辐照血小板并且持续时间至少到出生后6个月；对于输注来自1级和2级亲属的血小板均宜辐照；宫内输血和换血时，宜选择采集后5 d以内的血液做辐照，并在辐照后24 h内输注；对于霍奇金氏淋巴瘤成人和儿童患者宜终生输注辐照血小板。但指南不推荐对所有血液均进行大规模的辐照，对于造血干细胞移植患者、严重细胞免疫缺陷患者、胎儿和新生儿、免疫能力特别强的个体等这类特殊病人，是否必须输注辐照血小板及输注后的治疗效果仍需高质量的数据支撑，对于某些特殊情况下患者急需输注血小板可以不用辐照，以免错过最佳的治疗时间。

此外潜在的细菌污染是造成血小板保存期短的一个重要原因，输注含有细菌的血小板的患者可能会发生严重感染，伽马射线辐照灭活细菌受细菌类型及细菌浓度的限制，细菌浓度过高时，伽马辐照不足以使细菌失活，而对极低浓度的细菌污染，伽马辐照也会受到细菌性质（革兰氏阳性及阴性）等因素的影响[38]，目前推荐的伽马辐照血液的剂量对不同的细菌种类、细菌浓度的灭活仍有待进一步研究。

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