rAAV2-ND4基因玻璃体腔注射对Leber遗传性视神经病变的疗效评价

李欣 田朕 陈彰 李斌,2,3 张勇

1十堰市太和医院眼科 湖北医药学院附属医院,十堰 442000；2华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，武汉 430030；3武汉纽福斯生物科技有限公司 420200

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是由线粒体DNA突变所致的遗传性眼病，常见的突变位点为11778[1]，临床表现为双眼视力同时或先后急性或亚急性下降[2]。本病好发于青少年男性，是导致青少年双眼盲的常见原因之一，很多患者在较短时间内双眼视力急剧降至0.1以下。目前LHON的治疗方法包括口服Q10、艾地苯醌、EPI-743等[3-5]，但均未获得确切的疗效。本研究团队前期进行了一系列基础研究，证实重组腺相关病毒2-还原型辅酶Ⅰ脱氢酶4(recombinant adeno associated virus 2-NADH dehydrogenase 4，rAAV2-ND4)能够正常表达于线粒体或注射后进入细胞的线粒体内[6]，验证了rAAV2-ND4玻璃体腔内注射的安全性和有效性，确定了注射剂量[7]。在完成前期基础研究后，本研究团队于2011—2012年对9例LHON患者进行了首次基因治疗临床试验，随访36个月发现6例患者视力显著提高，未见严重并发症发生[8-9]，初步证实了基因治疗LHON的安全性和有效性。此后，法国和美国的研究团队也分别进行了基因治疗LHON的临床试验，但均出现较严重的眼部并发症[10-11]。为了进一步扩大样本量以证实基因治疗药物的安全性和有效性，本团队开展第2次基因治疗LHON的临床试验，以期为rAAV2-ND4玻璃体腔内注射治疗LHON提供方法学和临床疗效评价依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用多中心前瞻性非随机对照临床试验研究设计，研究团队由十堰市太和医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、武汉大学附属鄂州市中心医院以及阿根廷布宜诺斯艾利斯的佩德罗·拉格莱泽眼科医院临床医生组成，并于2017年12月至2018年2月在十堰市太和医院眼科中心招募线粒体DNA 11778位点突变的LHON患者40例。选择视力较差眼或右眼(双眼视力相等时)行rAAV2-ND4玻璃体腔内注射作为注射眼组，对侧眼作为未注射眼组，每组40眼。LHON诊断标准：(1)急性或亚急性起病，无痛性视力下降；(2)单眼发病或双眼相继发病；(3)视觉诱发电位提示P100波潜伏期延长、振幅降低；(4)中心视野缺失或色觉障碍；(5)早期视盘正常或轻度充血、水肿，视盘旁局部微血管扩张，无出血、渗出，晚期视盘颞侧苍白；(6)基因测序结果符合LHON诊断。纳入标准：(1)符合LHON诊断标准，并且通过基因测序确定为11778位点突变，近3个月未经其他治疗，且视力未提高；(2)年龄12～65岁，病程>6个月且视力稳定；(3)同意治疗期间不使用其他针对此疾病的药物或治疗方法。排除标准：(1)合并有糖尿病等慢性疾病，严重的心血管、脑血管、肝脏、肾脏等原发病，其他全身神经性疾病者，心脏病手术后恢复期患者，有精神障碍的患者，肿瘤患者；(2)合并有青光眼等其他影响视力的眼部疾病患者；(3)近3个月内参加其他临床研究的患者；(4)酗酒、吸烟、吸毒或有药物滥用史、有毒物质接触史者；(5)孕妇、哺乳期妇女或12个月内有计划怀孕者；(6)术前免疫实验检查结果明显异常者，如AAV2体液免疫反应阳性、CD3/CD8异常等。40例患者均双眼发病，其中男33例，女7例；病程为7～312个月，平均(41.30±56.08)个月；年龄为12～42岁，平均(20.30±6.39)岁；注射眼和未注射眼平均最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)分别为(1.83±0.47)LogMAR和(1.75±0.46)LogMAR，差异无统计学意义(t=0.813，P=0.419)；注射眼组和未注射眼组平均基线眼压分别为(17.63±2.56)mmHg和(17.88±2.64)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，差异无统计学意义(t=0.430，P=0.669)。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，研究方案获得十堰市太和医院伦理委员会批准(批文号：201807)。在充分告知研究内容及手术风险后，所有患者和监护人均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1手术方法 手术在手术室进行，患者取平卧位，术眼用盐酸丙美卡因滴眼液点眼3次；常规消毒铺巾，做好面部及眼部消毒；术眼用开睑器开睑，体积分数0.5%聚维酮碘消毒液冲洗结膜囊，10 s后用质量分数0.9%氯化钠溶液冲洗，洗净消毒液；用1 ml注射器吸取0.05 ml rAAV2-ND4(1×1010vg)(武汉纽福斯生物科技有限公司)，沿注射眼顺时针7：00～8：00位角膜缘后4 mm处进针，缓慢推注药物，拔出针头后无菌棉签按压注射点2 min；术眼涂抗生素眼膏并包盖，患者平卧30 min后返回病房。手术操作均由同一高年资医师进行。

1.2.2随访及评价指标 术后1、3、6、12个月定期检查视力、眼压、眼前节及眼底等。评估患者治疗的有效率，定义为末次随访时视力提高≥0.3 LogMAR。主要终点指标为视力变化，由同一医生采用两用对数视力表(温州星康医学科技有限公司)检查视力，并转换成LogMAR视力；采用Full Auto Tonometer(日本Canon公司)喷气式非接触眼压计测量眼压3次，取平均值；采用裂隙灯显微镜检查眼前节情况；采用CR-2免扩瞳眼底照相机(日本Canon公司)检查眼底。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验证实接近正态分布，以mean±SD表示；计数资料以频数及百分率表示。注射眼组和未注射眼组基因治疗前后BCVA和眼压总体比较均采用重复测量两因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者治疗有效率

治疗后，注射眼组视力提高6眼，未注射眼组视力提高4眼，双眼视力同时提高13例。40例患者中23例患者视力提高≥0.3 LogMAR，有效率为57.5%。

2.2 各组术眼治疗前后BCVA比较

2个组BCVA总体比较差异无统计学意义(F组别=0.084，P=0.772)，治疗前后BCVA总体比较差异有统计学意义(F时间=34.109，P<0.01)；治疗后12个月2个组BCVA均较治疗前提高，差异均有统计学意义(均P<0.01)(表1)。

表1 2个组治疗前和治疗后12个月BCVA比较(mesn±SD,LogMAR)Table 1 Comparison of BCVA between the two groups before and after 12-month treatment (mesn±SD,LogMAR)组别眼数治疗前后BCVA治疗前治疗后12个月未注射眼组401.75±0.461.51±0.62a注射眼组401.83±0.471.62±0.58a 注:F组别=0.084,P=0.772;F时间=34.109,P<0.01.与治疗前比较,aP<0.01(重复测量两因素方差分析,LSD-t检验) BCVA:最佳矫正视力 Note:Fgroup=0.084,P=0.772;Ftime=34.109,P<0.01.Compared with pre-treatment,aP<0.01 (Repeated measurement two-way ANOVA,LSD-t test) BCVA:best corrected visual acuity

2.3 各组术眼治疗前后眼压比较

2个组术眼治疗前后眼压总体比较差异均无统计学意义(F组别=0.557，P=0.575；F时间=2.314，P=0.106)(表2)。

表2 2个组治疗前后眼压比较(mesn±SD,mmHg)Table 2 Comparison of intraocular pressure between the two groups before and after treatment (mesn±SD,mmHg)组别眼数治疗前后不同时间点眼压治疗前治疗后1个月治疗后12个月未注射眼组4017.88±2.6418.25±2.2317.93±2.46注射眼组4017.63±2.5618.55±3.1417.85±2.51 注:F组别=0.557,P=0.575;F时间=2.314,P=0.106(重复测量两因素方差分析) 1mmHg=0.133kPa Note:Fgroup=0.557,P=0.575;Ftime=2.314,P=0.106 (Repeated measurement two-way ANOVA) 1mmHg=0.133kPa

2.4 注射眼并发症发生情况

随访期内，所有患者rAAV2-ND4玻璃体腔内注射后均无结膜炎、角膜炎、前房炎症、玻璃体炎症及视网膜脱离出现。2眼注射治疗后眼压偏高，约为26 mmHg，使用盐酸卡替洛尔滴眼液点眼，每日2次，眼压恢复至正常。

3 讨论

2007年，美国和英国3个研究小组针对Leber先天性黑矇成功开展了基因治疗临床试验[12-13]，开启了眼部疾病的基因治疗时代。LHON的发生是由于11778位点突变造成呼吸链上ND4基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸所致，导致ND4蛋白功能异常。基因治疗就是把未突变的ND4基因转染到患者病变部位的细胞，编码正常的ND4蛋白，替代患者体内突变的ND4蛋白的功能。基因治疗是目前治疗LHON最有前景的方法，其安全性是首先要保证的问题。由于玻璃体腔内注射AAV2载体会诱发机体的免疫排斥反应，从而影响药物效果，本课题组在前期动物实验阶段确定了AAV2引起机体免疫反应的时间和峰值及用药方案[14]，从而降低了机体免疫排斥发生的风险。法国GenSight Biologics公司和美国Guy教授研究团队用AAV2作为载体对LHON患者进行基因治疗后，均出现不同程度的玻璃体炎症或葡萄膜炎[10-11]。此后法国GenSight Biologics公司证实了眼内炎症反应与AAV2载体有关，并提出预防性系统地使用糖皮质激素可以减轻炎症反应[15]。本研究中所有患者基因治疗前1周和治疗后4周均应用糖皮质激素，以减少免疫排斥反应的发生机会，术中及术后随访期内均未发生任何严重并发症，证实了基因治疗的安全性。

2011—2012年，本研究团队首次使用rAAV2-ND4治疗9例LHON患者并随访7年，有6例患者视力显著提高(视力提高≥0.3 LogMAR)，有效率超过60%[16]。本研究结果显示，rAAV2-ND4玻璃体腔内注射后有效率达57.5%，与前期研究结果一致，进一步证实了LHON基因治疗的有效性。此外，值得注意的是，2次基因治疗结果显示，不仅注射眼视力较基线提高，未注射眼视力也出现不同程度的提高。Yu-Wai-Man等[17]对37例m.11778G突变的LHON患者注射眼采用随机分配原则，选择1眼进行rAAV2/2-ND4治疗，在96周的随访期间观察到双眼视力的持续改善，结果显示在第96周，68%(25/37)的受试者至少有1眼的BCVA较基线水平有临床相关的恢复，78%(29/37)的受试者双眼视力改善，表明单眼基因治疗可以明显改善双眼视力。造成这种双眼视力提高的机制仍不完全明确。一项非人灵长类动物的研究结果发现，病毒载体DNA可从注射眼转移到对侧未注射眼的前节、视网膜和视神经(https://www.gensight-biologics.com)。此外，Yang等[18]将荧光金注射到鼠一侧眼的玻璃体腔内，2周后可见荧光金上行到对侧视交叉，经过视交叉后，部分进入对侧眼的视神经，这为药物单眼注射后双眼视觉功能改善提供了一个合理的解释，但物质转移是通过轴浆运输、轴突再生或其他方式仍不清楚，需要进一步探索。

本研究的优势在于国内缺少基因治疗临床实践的相关报道，仅限于对外文文献的参考和总结，本研究为我国LHON的基因治疗提供了临床依据。因本研究未设置正常对照组，而且单眼基因治疗改变的是双眼视功能，故未进行玻璃体腔内注射rAAV2-ND4治疗的眼不能作为对照组。因此，40例患者80眼均以基因治疗前后的视力变化进行对比分析。本研究的不足之处在于未设置自然病程作为对照组，同时缺少自然病程患者分析。本研究未进行视力提高与未提高患者的相关性影响因素分析，未纳入视野、视神经纤维层厚度和视觉诱发电位等客观检测指标。

本研究结果表明，玻璃体腔内注射rAAV2-ND4治疗LHON是安全、有效的，研究结果为未来LHON基因治疗走向临床提供了理论依据。本研究团队将继续对40例患者进行长期跟踪随访，观察患者全身情况，并结合视野、视神经纤维层厚度和视觉诱发电位等客观检查资料评价基因治疗后患者视功能的改善情况，探讨基因治疗LHON的远期安全性和有效性。

利益冲突李斌教授为武汉纽福斯生物科技有限公司董事长，是基因药物rAAV2/2-ND4的发明者；本研究所用基因药物来自武汉纽福斯生物科技有限公司；本研究承担单位为公立三级甲等医院，所有数据均为客观检查获得，研究结果不会受到影响;其余作者均声明不存在利益冲突