两个汉族家族性玻璃体淀粉样变性家系突变基因检测及临床表型分析

郑巍 李海波 张雪咏 周学智 陈媛媛 毛俊峰

中南大学湘雅医院眼科，长沙 410008

家族性玻璃体淀粉样变性(familial vitreous amyloidosis，FVA)是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，因淀粉样物质在玻璃体内的沉积而致病，可独立发病，也可同时累及全身多个器官和组织[1]，其发病与转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)基因突变密切相关。TTR主要由肝脏(约占90%)、脉络丛及视网膜色素上皮细胞合成，目前已报道的TTR基因致病性突变有100多种，存在一定的种族及地域差异性[2-4]。本研究收集并分析2个FVA家系的临床资料，以进一步探讨我国汉族人群玻璃体淀粉样变性的临床特征及基因突变位点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用家系调查研究，收集2015年1月至2018年12月于中南大学湘雅医院就诊的2个汉族玻璃体淀粉样变性家系。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经中南大学湘雅医院医学伦理委员会审核批准(批文号：201412463)。所有受检者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1全身及眼部检查 详细记录2个家系所有成员的病史和家族史，并进行全身体格检查、心电图、胸部正侧位片和眼部检查(包括视力、裂隙灯显微镜、眼底、眼压、眼部B型超声检查)。

1.2.2基因测序 采集家系1(湖南株洲，MZ001)中15例患者(男9例，女6例)、家系2(湖南常德，MZ002)中7例患者(男2例，女5例，I2未纳入)以及家系1、家系2中各5名无临床症状者外周静脉全血各5 ml，经乙二胺四乙酸抗凝，采用酚/氯仿法抽提gDNA。采用PCR试剂盒(上海生工生物技术有限公司)在ABI-2720 PCR扩增仪(美国ABI公司)上扩增TTR基因的4个外显子片段。gDNA参考序列版本为GRCh38/hg38(2013年12月发布)，引物设计与合成均由上海生工生物技术有限公司完成，4个外显子的PCR引物设计见表1。将PCR扩增产物交由上海铂尚生物技术有限公司在ABI-3730XL型测序仪(美国ABI公司)上进行双向测序，测序结果采用SeqMan软件和Chromas软件进行分析，并将测序结果与野生型TTR基因完整序列的4个外显子进行比对。

表1 TTR基因外显子1、2、3、4的检测引物Table 1 Primers of TTR gene exons 1,2,3 and 4引物名称引物序列(5’-3’)产物大小(bp)外显子1正向:AACGAATGTTCCGATGCTCT354反向:GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC外显子2正向:CGTTCCTGATAATGGGATCA320反向:CTACCAAGTGAGGGGCAAAC外显子3正向:GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT272反向:GCCAAAAGCAAAAACCAAAA外显子4-1正向:TCTAAGGACTGTGCATGGTTCC504反向:TTTGGAAGGGACAATAAGGGAA外显子4-2正向:GACGAGGGATGGGATTTCATGT483反向:TACACCACTGCATTCTAGCCTG 注:TTR:转甲状腺素蛋白 Note:TTR:transthyretin

1.2.3玻璃体切割手术 MZ001家系先证者Ⅲ13和MZ002家系先证者Ⅱ11均因玻璃体严重混浊行经睫状体平坦部23G玻璃体切割手术联合白内障超声乳化摘出联合人工晶状体植入术。行三通道玻璃体切割，术中人工诱导玻璃体后脱离，注入少量曲安奈德对玻璃体进行染色，顶压巩膜尽量切割周边部玻璃体，并仔细检查，未见视网膜裂孔，术中取玻璃体标本后送组织病理学检查，术毕灌注液填充玻璃体腔。

1.2.4玻璃体标本的组织病理学检查 术中开放气体灌注维持眼压，从玻璃体切割管道中直接抽取病变玻璃体进行铺片、脱水固定。切片浸入质量分数0.5%刚果红染液15 min，水洗后光学显微镜下观察，淀粉样变性组织呈红色阳性反应。

2 结果

2.1 2个FVA家系成员的临床特征

2个家系均符合常染色体显性遗传。MZ001家系4代共63名家系成员，其中男29人，女34人；FVA患者15例，均为双眼发病，发病率为23.8%，发病年龄为36～51岁，平均(43.6±5.8)岁。MZ002家系4代共49人，其中男23人，女26人；FVA患者共7例，均双眼发病，发病率为14.3%，发病年龄为43～59岁，平均(50.4±5.5)岁(图1)。

图1 2个FVA家系图 A：MZ001家系 B：MZ002家系 □：健康男性；○：健康女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先证者Figure 1 Pedigree map of MZ001 and MZ002 A:MZ001 pedigree B:MZ002 pedigree □:healthy male；○:healthy female；■:male patient；●:female patient;/:deceased；:the proband

2个家系的FVA患者具有相似的眼部临床表现，双眼同时或先后发病，结膜、角膜、前房未见淀粉样物质沉积，房角镜检查各方向房角开放。晶状体后囊可见玻璃体混浊物黏附，呈足盘样。玻璃体内可见大量白色颗粒样混浊物，飘动如棉纱样，玻璃体混浊的严重程度随发病时间延长而加重，严重者眼底结构模糊不清。B型超声检查显示玻璃体中度混浊，MZ001家系先证者Ⅲ13无玻璃体后脱离，MZ002家系先证者Ⅱ11伴有扁平状玻璃体后脱离(图2，3)。

MZ001家系中患者均未发现伴有神经系统、心脏、肾脏、肝脏等全身其他器官系统疾病。MZ002家系中，有3例患者出现不同程度的手足麻木症状，无腹泻、高血压或头晕等。MZ002家系Ⅱ3患者因双眼玻璃体混浊曾先后2次在中南大学湘雅医院行玻璃体切割术，该患者去世时有四肢麻木、严重的肌力下降和肌肉萎缩症状。

2.2 FVA患者的术中、术后临床表现和特征

MZ001家系Ⅲ13患者术中发现玻璃体混浊黏稠、致密，诱导玻璃体后脱离较困难，在赤道部附近，玻璃体与视网膜粘连紧密，玻璃体难以切割干净。MZ002家系Ⅱ11患者玻璃体混浊较松软，术中易于诱导完全的玻璃体后脱离，并可将周边玻璃体混浊彻底清除。玻璃体组织铺片刚果红染色结果显示,淀粉样物质呈红色阳性反应(图2，3)。

MZ001家系Ⅲ13患者术前眼压为15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，术后6个月眼压升高至30 mmHg，诊断为开角型青光眼，酒石酸溴莫尼定滴眼液点眼后眼压可控制在正常范围，术后1年复查发现玻璃体内再次出现白色颗粒样混浊。MZ002家系Ⅱ11患者术前眼压为16 mmHg，术后眼压为13 mmHg，随访2年未见眼压升高及玻璃体混浊复发。

2.3 2个FVA家系成员TTR基因序列变化

在MZ001家系的所有患者中，TTR基因第3外显子第83位氨基酸发生突变，cDNA307位的G峰下方出现1个C碱基套峰，野生型无此套峰，相应的密码子由GGC突变为CGC(图2)，即由甘氨酸突变为精氨酸(Gly83Arg)。

图2 MZ001家系先证者Ⅲ13眼部临床表现及基因测序结果 A：裂隙灯显微镜照相可见足盘样玻璃体混浊黏附于晶状体后囊 B：眼底照相可见玻璃体大量混浊物如棉纱样 C：B型超声检查示玻璃体中度混浊，无玻璃体后脱离 D：玻璃体切割术中可见后极部覆盖曲安奈德染色的玻璃体 E：玻璃体组织病理学检查可见玻璃体组织淀粉样物质呈红色阳性反应(刚果红，标尺=200 μm) F：基因测序结果显示TTR基因第83位氨基酸出现杂合突变，由GGC突变为CGC(箭头)，由甘氨酸突变为精氨酸(Gly83Arg)Figure 2 Ocular clinical manifestations and gene sequencing of proband Ⅲ13 in MZ001 family A:The pedal disc shaped deposits were attached to the posterior lens capsule by slit lamp microscopy B:Cotton wool-like deposits in the vitreous observed by fundus photography C:Moderate vitreous opacity with no posterior detachment was found by B-ultrasound D:During vitrectomy，the posterior pole of fundus was covered with triamcinolone stained vitreous E:The vitreous tissue collected during vitrectomy was with positive Congo red staining by histopathological examination (Congo red，bar=200 μm) F:Gene sequencing results of TTR showed a G to C transversion (arrow) resulting in the replacement of glycine-83 with arginine (Gly83Arg)

在MZ002家系的所有患者中，TTR基因第2外显子第36位氨基酸发生突变，cDNA166位的G峰出现1个C碱基套峰，野生型无此套峰，相应的密码子由GCT突变为CCT(图3)，即由丙氨酸突变为脯氨酸(Ala36Pro)。

图3 MZ002家系先证者Ⅱ11眼部临床表现及基因测序结果 A：裂隙灯显微镜照相示晶状体后囊白色足盘样混浊物附着 B：眼底照相可见玻璃体混浊呈棉纱样，眼底窥不清 C：B型超声检查可见玻璃体中度混浊，伴部分玻璃体后脱离 D：玻璃体切割术中可见容易诱导玻璃体后脱离，周边玻璃体松软 E：玻璃体组织病理学检查可见淀粉样物质呈红色阳性反应(刚果红，标尺=200 μm) F：基因测序结果显示TTR基因第36位氨基酸出现杂合突变，由GCT突变为CCT(箭头)，由丙氨酸突变为脯氨酸(Ala36Pro)Figure 3 Ocular clinical manifestations and gene sequencing of the proband Ⅱ11 in MZ002 family A:The pedal disc shaped deposits were attached to the posterior lens capsule by slit lamp microscopy B:Cotton wool-like deposits in the vitreous were found by fundus photography，which lead to the blurred fundus C:Moderate vitreous opacity with no posterior detachment was found by B-ultrasound D:During vitrectomy，it was easy to induce the vitreous detachment，and the peripheral vitreous was loose E:The vitreous tissue collected during vitrectomy was with positive Congo red staining by histopathological examination (Congo red，bar=200 μm) F:Gene sequencing results of TTR showed a G to C transversion (arrow) resulting in the replacement of alanine-36 with proline (Ala36Pro)

3 讨论

FVA是一种临床罕见的常染色体显性遗传性疾病，其发病与TTR基因突变密切相关，本研究中纳入的2个家系有着不同基因突变位点，呈现出不同的临床特征。MZ001家系较MZ002家系发病早，玻璃体混浊症状更重，其先证者周边部玻璃体皮质黏稠致密，术中切割时需谨慎操作，避免发生医源性视网膜裂孔；MZ002家系先证者的玻璃体松软，容易诱导玻璃体后脱离，周边的混浊玻璃体较易切净。MZ001家系患者均不合并全身其他系统异常症状；MZ002家系中有3例患者有不同程度的手足麻木感，Ⅱ3还出现了严重的肌力下降合并肌肉萎缩症状，提示可能有淀粉样物质在神经系统沉积。

FVA可单独发病，也可表现为家族性淀粉样变性多发神经病变(familial amyloid polyneuropathy，FAP)的眼部受累。FAP是一组常染色体显性遗传疾病，由淀粉样纤维在各组织器官沉积引起，可累及全身多个系统，甚至危及生命[5]。淀粉样物质在玻璃体的沉积可以是孤立发病，也可伴随全身多系统受累，在目前已知的7种可导致FVA发生的突变基因中，以TTR基因突变最为常见。以往文献报道中，Val30Met是全球范围内TTR最常见的突变[6]。近年来，国内也有一些与FAP有关TTR基因突变的报道，如Lys35Thr、Gly83Arg、Ala36Pro、Ala97Ser、Tyr114Cys等[3,7-15]。本研究中对2个汉族FVA家系患者的检测发现，这2个家系尽管均是TTR基因突变，但突变位点并不相同，分别是c.307G>C和c.166G>C，推测其可能是导致2个家系临床表现存在差异的根本原因，这2个突变位点导致临床表型不同的具体原因还有待进一步研究。目前，Gly83Arg突变仅在国内汉族家系中有发现，在国外其他种族中尚未见报道，该突变引起的FAP症状不同于其他突变，往往以眼部症状先发，且全身其他系统症状出现晚、症状轻，甚至不出现，本研究中MZ001家系FVA患者仅出现双眼玻璃体混浊。也有研究表明，在转基因小鼠模型中Gly83Arg突变导致玻璃体淀粉样物质沉积是其唯一症状[16]。因此，本研究推测Gly83Arg可能是我国汉族人群玻璃体淀粉样变性特有的突变。

玻璃体切割术是治疗FVA最直接和有效的方式，但术后仍有可能复发[17-18]，术后应特别注意继发性青光眼的监测。MZ001家系Ⅲ13术后出现了开角型青光眼症状，而MZ002家系Ⅱ11术后并无眼压升高。青光眼的发生一般与淀粉样物质在小梁网沉积进而阻滞房水排出有关[19]。此外，MZ002家系中Ⅳ7也检测到携带TTR基因Ala36Pro突变，因年龄较小目前尚未发病，有待进一步的随访观察。

综上所述，本研究结果显示FVA可能与TTR基因的Gly83Arg或Ala36Pro突变有关，二者引起的临床表型有所不同，其中Gly83Arg突变的患者玻璃体混浊更严重，发病年龄更早，不伴有全身其他器官系统受累，术后可伴发青光眼；而Ala36Pro突变的患者多伴有四肢麻木、肌力下降等全身症状，双眼可先后发病，双眼玻璃体混浊程度不一致，术后未伴发青光眼。本研究着重对2种突变引起FVA患者的临床表型进行了分析和对比，对2种突变在玻璃体切割手术难易度、继发青光眼、全身伴随症状等方面进行了阐述，突变位点的致病性仍有待进一步研究证实。

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