GⅡ.17型诺如病毒人源中和性单链抗体制备及生物特性鉴定①

王璐 侯玉珍 曾志云 谢东杰 邱梦丝 张绪富戴迎春

（南方医科大学公共卫生学院流行病学系，广州510515）

诺如病毒（norovirus，NoV）是引发全球各年龄段人群急性胃肠炎（acute gastroenteritis，AGE）暴发流行及散发的主要病原体，占全球AGE发病的近20%［1］。NoV的低感染剂量及传播途径多样化，在医院、养老院、学校、托儿中心及餐馆等半封闭环境中迅速传播［2-4］。全球范围内，NoV感染每年可导致约6.99亿病例和22万人死亡，医疗费用达40亿美元以上，因丧失劳动力产生的间接社会费用超过600亿美元［1，5］。我国NoV发病率为80万例/年，年均发病率为6.0/100人年，5岁以下儿童年均发病率约为15.6/100人年［6］。因此，NoV暴发流行及散发是我国及世界范围内的重要公共卫生问题。

NoV属杯状病毒科，是单股正链小RNA病毒，直径约27~38 nm，基因组全长约7.4~7.7 kb，可识别人类组织血型抗原（histo-blooding group antigen，HBGA）作为受体或病毒附着因子，HBGA是研究NoV易感性和致病性的重要因素［7-10］。基于VP1氨基酸序列的多样性，可将其分为GⅠ~GⅩ共10个基因组，共49个基因型［11］。GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人类，其中GⅡ.4 NoV是1996年以来暴发流行及散发最主要基因型，占所有NoV相关胃肠炎暴发的70%~80%［6，12］。2014年以来，中国、日本等亚洲国家均报道了由GⅡ.P7~GⅡ.17新变异株引发的NoV相关胃肠炎暴发［13-15］。2014~2015年，这一变异株在NoV暴发中占76.9%，取代GⅡ.4/2012 Sydney株成为我国2014~2015年和2015~2016年NoV流行的主要流行株［16］。

目前，NoV疫苗和特异性抗体药物研究主要集中于GⅡ.4，本团队前期研究表明，GⅡ.4预存抗体对与GⅡ.17感染无明显交叉保护作用，因此建议将GⅡ.17纳入NoV候选疫苗研制范畴，开展其中和抗体及抗原表位研究［17］。本研究基于一起GⅡ.17 NoV感染引发的急性胃肠炎暴发，采集患者恢复期外周血，采用噬菌体展示技术构建NoV噬菌体抗体库，筛选特异性GⅡ.17 NoV单链抗体，并进行原核系统表达，得到中和性单链抗体，为NoV临床防治及相关疫苗研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶NotⅠ/SfiⅠ/BamHⅠ、GeneJET Gel Extraction Kit、GeneJET Plasmid Miniprep Kit、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase购自Thermo Fisher Scientific；High Pure Viral RNA Kit购自罗氏公司；NoV荧光定量检测试剂盒购自上海之江生物科技有限公司；Ficoll-PaqueTMPLUS Media淋巴细胞分离液、HRP-鼠抗M13单克隆抗体和凝血酶购自GE公司；T4连接酶 和DNA Marker购 自TaKaRa公司；免疫管购自NUNC公司；96孔酶标板购自Corn‑ing公 司；2×Phanta Max高 保 真 聚 合 酶 和ClonEx‑press®ⅡOne Step Cloning Kit购自诺唯赞公司；TMB、大肠杆菌E.coliTG1购自碧云天公司；大肠杆菌E.coli TOP10和BL21购自天根生物技术有限公司；噬菌粒载体pCANTAB-5E购自Amersham Bio‑sciences公 司；pGEX-4T-1质 粒、辅 助 噬 菌 体M13KO7、GⅡ.17/GⅡ.4/GI.3 NoV P颗 粒、鼠 抗GⅡ.17/GⅡ.4/GⅠ.3 NoV血清和分泌型B型唾液为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及病例定义2017年12月25日广州市某部队暴发一起以呕吐、腹泻等为主要症状的急性胃肠炎［18］。采集患者肛拭子或粪便样本18份，2018年1月16日（暴发后3周）采集患者恢复期外周血13份，患者知情同意。根据《NoV感染暴发调查和预防控制技术指南（2015版）》，临床诊断病例为2017年12月25日以来，该部队所有官兵出现腹泻（≥3次/24 h，伴有大便性状改变）或呕吐（≥3次/24 h）之一者；确诊病例定义为粪便或肛拭子标本经NoV核酸检测呈阳性的临床诊断病例［19］。

1.2.2 粪便混悬液制备与总RNA提取采用PBS将粪便配制为10%~20%悬液，剧烈振荡1 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清，-80℃保存。按照High Pure Viral RNA Kit说明书，从肛拭子或粪便样本中提取病毒核酸，得到的总RNA用于RTRCR检测或-80℃保存。实验均在二级生物安全柜中进行。

1.2.3 RT-PCR和实时荧光RT-PCR按照Rever‑tAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书对总RNA进行RT-PCR检测。根据NoV荧光定量检测试剂盒说明书检测NoV GⅠ、GⅡ型。判断标准：Ct≤30为阳性；30

1.2.4 NoV基因序列扩增、纯化及序列分析按照Phusion High-Fidelity DNA Polymerase说明书，扩增NoV衣壳蛋白基因区N/S端基因序列，判断NoV基因型；扩增P区域基因序列，构建进化树。根据GeneJET Gel Extraction Kit说明书，对PCR产物进行纯化，并将产物送华大基因公司进行测序。采用DNAStar中的MegAlign分析核苷酸序列同源性，Mega 4.0软件分析基因序列，邻接法（neighbor-join‑ing，NJ）构建系统进化树，自展法（bootstrap）进行可信度检测，重复次数设为1 000。

1.2.5 患者恢复期外周血中总RNA提取按照密度梯度离心法，采用Ficoll-PaqueTMPLUS Media淋巴细胞分离液从NoV患者恢复期外周血中分离PBMC和血浆，Trizol法提取PBMC总RNA，并进行RT-PCR检测，采用随机引物合成cDNA第一链。

1.2.6 pCANTAB-5E-scFv重组质粒构建参考文献［20-21］，设计合成扩增人抗体基因引物。以cD‑NA第一链为模板，分别采用抗体重轻链的混合正反向引物扩增抗体重轻链基因（VH和VL）；以等量VH和VL为模板，重叠PCR将两者随机拼接成scFv；采用限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ分别将pCANTAB-5E和scFv双酶切，回收双酶切片段；采用用T4连接酶将两者纯化产物16℃连接过夜，所得产物即为重组质粒pCANTAB-5E-scFv。

1.2.7 人源GⅡ.17型NoV噬菌体单链抗体库构建将重组质粒电转化至感受态细胞E.coli TG1中，37℃、180 r/min振荡培养1 h，取少量菌液梯度稀释，铺SOB-AG固体培养基30℃培养过夜；次日随机挑取单克隆抗体进行菌落PCR，选取阳性克隆测序，鉴定抗体库重组率和多样性，测定抗体库初级库容；剩余菌液加入辅助噬菌体M13KO7和氨苄青霉素（100 mg/ml），37℃孵育30 min，37℃、180 r/min振荡培养1 h；1 000 g离心10 min，弃上清，采用2×YT-AK培养基混匀菌体，37℃、250 r/min振荡培养12~16 h；次日4℃、1 000 g离心15 min，收集上清，PEG/NaCl沉淀重组噬菌体颗粒，混匀，冰上孵育30 min；4℃、10 000 g离心30 min，弃上清，1%BSA重悬沉淀；4℃、10 000 g离心5 min，收集上清，即得到人源抗NoV噬菌体单链抗体库。取少量菌液梯度稀释，加入对数期TG1，室温孵育15 min，铺板，过夜培养，数克隆数，计算抗体滴度。实验均在二级生物安全柜中进行。

1.2.8 噬菌体抗体库筛选以GⅡ.17 NoV P颗粒（5µg/ml）为固相抗原，包被免疫管，4℃孵育过夜，PBS洗2遍，5%脱脂奶封闭，37℃孵育2 h，PBS洗2遍，加入1 ml噬菌体抗体库，37℃孵育2 h，0.05%PBST洗9~15遍，加入对数期E.coli TG1直接感染，37℃孵育15 min，移至培养瓶，补加2×YT-A培养基；向免疫管内加入0.1 mol/L甘氨酸-盐酸洗脱液（pH=2.2）37℃孵育10 min，颠倒数次，加入2 mol/L Tris中和液（pH=8.8）快速混匀，再次加入对数期TG1，37℃孵育15 min；将免疫管中菌液转移至上述培养瓶，混匀，取少量菌液铺氨苄抗性琼脂板，隔日计算产出量，37℃、220 r/min振荡培养1 h，补加2×YT-A培养基，培养至对数生长期，加入辅助噬菌体M13KO7，并加入卡那霉素（50 mg/ml），30℃、220 r/min振荡培养过夜；次日4℃、8 000 r/min离心15 min，收集上清，加入PEG/NaCl充分混匀，冰浴30 min；4℃、8 000 r/min离心30 min，弃上清，1% BSA重悬沉淀；4℃、10 000 g离心5 min，收集上清。取少量上清梯度稀释，铺氨苄抗性琼脂板，隔日计算投入量，并进行下一轮筛选，“吸附-洗涤-洗脱-感染-拯救”共4轮，最终富集与GⅡ.17 P颗粒特异性结合的噬菌体单链抗体。实验均在二级生物安全柜中进行。

1.2.9 Phage-ELISA鉴定及DNA序列分析第4轮洗脱后挑取琼脂板上单克隆，加入2×YT-A培养基，37℃、200 r/min振荡培养8 h，补加辅助噬菌体M13KO7，30℃、200 r/min振荡培养过夜；次日室温1 000 r/min离心5 min，收集噬菌体上清。实验均在二级生物安全柜中进行。将GⅡ.17 NoV P颗粒（0.1µg/ml）、轮状病毒VP8*（对照抗原，0.1µg/ml）、PBS（空白对照）包被于96孔酶标板，以获得的噬菌体上清为一抗，同时以无噬菌体上清的培养基为阴性对照，HRP-antiM13抗体为二抗，TMB显色，测定各孔OD450，选取OD450值较高的阳性噬菌体克隆，送华大基因公司测序，DNA Star软件分析测序结果。

1.2.10 原核表达载体pGEX-scFv构建根据阳性克隆测序结果，挑取序列正确的克隆，设计scFv原核表达引物，在上下游引物中均引入载体pGEX-4T-1的两末端同源序列，分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点。以阳性克隆的菌液为模板，采用对应引物分别扩增scFv片段，根据ClonExpress®ⅡOne Step Cloning Kit说明书，将scFv片段重组克隆至线性化载体pGEX-4T-1，并将同源重组产物转化至感受态细胞E.coli T0P10，取菌液铺氨苄抗性琼脂板，37℃培养过夜。次日挑取单克隆进行菌液PCR，将阳性克隆送测序，并按照GeneJET Plasmid Miniprep Kit说明书提取重组质粒，即为重组原核表达载体

pGEX-scFv。

1.2.11 scFv原核表达及纯化将pGEX-scFv质粒转至感受态细胞E.coliBL21，取菌液铺氨苄抗性琼脂板，37℃培养过夜。次日挑取单克隆，37℃、200 r/min振荡培养过夜；按1∶100转接至LB培养基，37℃振荡培养至细菌对数期，加入1 mmol/L IPTG，22℃、220 r/min振荡过夜诱导表达。4℃、5 000 r/min离心12 min，收集菌体，PBS充分重悬菌体，冰浴中对其进行超声破碎；4℃、12 000 r/min离心75 min，收集上清，采用GST-resin亲和层析柱进行分离纯化，加入凝血酶，22℃酶切过夜，次日收集滤液，即为scFv可溶性抗体。

1.2.12 scFv抗体特异性鉴定将纯化后的scFv抗体稀释至终浓度为1µg/ml，包被于96孔酶标板，以GST蛋白为阴性对照，PBS为空白对照，4℃孵育过夜，封闭，加入GⅡ.17 NoV P颗粒（0.02µg/ml），37℃孵育1 h；以鼠抗GⅡ.17血清为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗，TMB显色，测定各孔OD450。

1.2.13 scFv抗体中和能力检测采用HBGA受体结合实验确定所用GⅡ.17 NoV P颗粒浓度，采用经预试验证实结合力强和稳定性高的B型抗原作为HBGA受体，与梯度稀释的GⅡ.17 NoV P颗粒结合，使其OD450为0.7~1.3。将HBGA表型明确的分泌型B型唾液标本稀释至终浓度为1∶1 000，包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；将已确定所用浓度的GⅡ.17 NoV P颗粒与4倍梯度稀释的scFv（稀释浓度为40、10、2.5 µg/ml）的混合液37℃孵育1 h，阳性对照采用未加scFv的P颗粒，阴性对照采用确定无阻断能力的血浆和P颗粒的混合液，空白对照采用1%脱脂奶粉-PBS代替scFv和P颗粒的混合液，加入酶标板，并以鼠抗GⅡ.17血清为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗，TMB显色，测定各孔OD450。阻断率（%）=（阳性对照OD450-实验组各孔OD450）/阳性对照OD450×100%。

1.2.14 scFv抗体与GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P颗粒交叉反应选取常见流行株GⅠ.3和GⅡ.4分别作为GⅠ和GⅡ型代表株，与单链抗体进行交叉反应。具体操作同1.2.12。

2 结果

2.1 暴发调查及NoV序列进化分析实时荧光RT-PCR检测结果显示，18份粪便或肛拭子样本中15份为GⅡNoV核酸阳性，RT-PCR扩增NoV衣壳蛋白N/S区序列并测序，经GenBank BLAST比对分析确定该急性胃肠炎暴发由GⅡ.17型NoV感染引起。GJ10、GJ11和GJ13株核苷酸序列同源性达99.7%~100%，并从GenBank中选取NoV VP1基因序列，构建系统进化树（图1）。

图1 GⅡ.17型NoV VP1部分基因进化树Fig.1 Phylogenetic analysis based on partial VP1 gene sequence of GⅡ.17 NoV

2.2 VH和VL基因扩增以PBMC中获得的cDNA第一链为模板，PCR扩增抗体重轻链可变区基因VH和VL（Vκ和Vλ），片段大小为300~500 bp，凝胶电泳结果见图2。

图2 VH和VL基因PCR扩增产物Fig.2 PCR amplification results of VH and VL

2.3 噬菌体抗体库构建及鉴定采用Overlap PCR将VH和VL拼接为约750 bp的scFv片段（图3A），将

其克隆至pCANTAB-5E，电转获得初级噬菌体抗体库，挑取单菌落进行PCR检测并测序，结果显示，各序列彼此不重复，说明该抗体库重组率和多样性均较好（图3B）。根据板上细菌生长情况，计算初级噬菌体抗体库库容约为2.4×107CFU/ml。

图3 scFv片段、抗体库菌落PCR产物Fig.3 PCR products of scFv and clones from antibody library

2.4 噬菌体抗体库富集以GⅡ.17 NoV P颗粒为固相抗原，对噬菌体抗体库进行4轮富集，噬菌体产出率从第1轮的2.8×10-7提升至第4轮的2.9×10-5，说明抗GⅡ.17 NoV特异性噬菌体单链抗体得到有效富集（表1）。

表1 噬菌体抗体库4轮筛选结果Tab.1 Results of 4 rounds of phage antibody library screening

2.5 Phage-ELISA鉴定及序列分析随机挑取第4轮筛选出的单克隆抗体，加入辅助噬菌体M13KO7拯救，包被GⅡ.17 NoV P颗粒，取噬菌体上清进行Phage-ELISA，将阳性菌液进行测序分析，最终得到11株序列不同且正确的单链抗体基因scFv（图4）。

图4 噬菌体阳性克隆Phage-ELISA鉴定Fig.4 Phage-ELISA identification of positive clones of phage

2.6 筛选后scFv DNA序列分析选取测序结果中1条核酸序列进行翻译，酶切位点SfiⅠ和NotⅠ间的scFv基因片段全长753 bp，其中VH片段为366 bp，编码122个氨基酸，VL为342 bp，编码113个氨基酸，连接肽为1条15个氨基酸的多肽片段（图5）。

图5 scFv测序及翻译结果分析Fig.5 Sequencing and translation analysis of scFv

2.7 全人源scFv表达以序列正确且翻译无误的阳性菌液为模板，PCR扩增scFv片段，将产物与载体pGEX-4T-1连接转化，构建原核表达载体pGEXscFv，并于感受态细胞E.coliBL21中表达，纯化所得抗体经SDS-PAGE电泳鉴定，可见9个约27 kD的目的蛋白（图6），与scFv大小相符，成功获得9株全人源单链抗体scFv。

图6 全人源scFv SDS-PAGE结果Fig.6 SDS-PAGE results of human scFv

2.8 scFv特异性鉴定采用ELISA鉴定scFv特异性，结果显示，9株抗体可与GⅡ.17 NoV P颗粒结合，均具有良好反应性（图7）。

图7 scFv特异性鉴定Fig.7 Identification of scFv specificity

2.9 scFv中和能力鉴定采用体外HBGA受体阻断实验确定9株scFv中和能力，即阻断GⅡ.17 NoV P颗粒与HBGA受体结合能力，结果显示，9株scFv随浓度增加，阻断率逐渐升高，40 µg/ml时阻断率均>50%，其中6A09中和能力最强，40µg/ml时阻断率达76.0%（图8）。

图8 scFv阻断GⅡ.17 P颗粒与HBGA结合的能力Fig.8 Ability of scFv to block GⅡ.17 P particle binding to HBGA receptor

2.10 scFv与GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P颗粒的交叉反应

ELISA鉴定scFv与GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P颗粒的交叉识别能力，结果显示，9株抗体与GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P颗粒均具有良好的交叉反应（图9）。

图9 scFv抗体与GⅡ.4/GⅠ.3 P颗粒的交叉反应Fig.9 Cross reaction between scFv and GⅡ.4/GⅠ.3 P particles

3 讨论

NoV是全球范围内引起各年龄AGE暴发、散发及流行的主要病原体，由于NoV流行株的抗原多样性、变异进化，且缺乏成熟的细胞培养系统及小动物感染模型，其疫苗和特异性抗病毒药物研究进展缓慢，过去30年，GⅡ.4 NoV一直是全球范围内的优势流行株，因此，现阶段NoV疫苗开发及研制主要集中于GⅡ.4，5种亚单位候选疫苗已进入临床和临床前研究阶段［22］。本团队前期研究表明，GⅡ.4抗体免疫对与GⅡ.17感染无交叉保护作用［17］，因此开展GⅡ.17 NoV特异性中和抗体及疫苗研制具有重要意义。

传统单克隆抗体制备主要采用杂交瘤技术，但获得的鼠源性单抗用于人类具有较强的免疫原性，易诱发人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HA‑MA）反应，导致其在体内半衰期较短，无法有效激活人体生物效应［23-25］。与前者相比，全人源抗体具有亲和力强、特异性高等特点，且无种属异源性，是重要的治疗性抗体药物。噬菌体抗体库技术是目前最成熟、应用最广泛的人源抗体制备技术之一，将抗体基因编码肽段和噬菌体外壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，再对抗体库进行多轮“吸附-洗脱-扩增”，可筛选出大量特异性抗体基因，具有高效、快捷、经济等优势，所得抗体库易于进行高通量筛选。与IgG和Fab相比，scFv具有可更好在原核系统中表达、耐受性好、免疫原性低、安全性和有效性更高等优点。中和性抗体也在抗病毒免疫保护中起重要作用［26-28］。目前采用该技术已成功制备多种FDA批准使用的人源单克隆抗体，如Ranibizumab用于湿性老年性黄斑变性治疗，Raxibacumab与抗菌药物联合用于吸入性炭疽的预防治疗等［28］。

本研究基于一起GⅡ.17 NoV引起的急性胃肠炎暴发，采集患者恢复期外周血，这一阶段，体内可产生大量记忆性B细胞，前期实验发现患者血浆中具有较高水平的中和抗体，为制备中和性scFv库提供保障；采用噬菌体展示技术获得库容约为2.4×107CFU/ml的全人源噬菌体抗体库，筛选得到11株与GⅡ.17 NoV特异性结合的scFv；在原核系统中进行表达纯化，得到9株高纯度scFv抗体；采用体外HBGA受体阻断实验对其中和能力进行鉴定，最终获得7株可明显阻断GⅡ.17与HBGA受体结合的scFv。其 中，Phage-ELISA结 果 显 示，1A06株 与GⅡ.17 P颗粒结合能力最强，与scFv特异性鉴定中的强弱结果不一致，原因可能为前者所用一抗为噬菌体抗体，而后续实验采用的是经原核系统表达纯化的scFv，噬菌体抗体和纯化后的抗体结构和性质可能有差异，而噬菌体自身外壳蛋白也可能影响scFv属性，从而导致Phage-ELISA与后续实验结果差异。该9株scFv与GⅡ.4和GⅠ.3 P颗粒交叉反应结果显示，GⅡ.17 NoV scFv对GⅡ.4/GⅠ.3有较好的交叉反应，说明该抗体可能对NoV其他亚型存在交叉识别现象。

本研究获得的具有中和能力的全人源抗GⅡ.17 NoV scFv具有高亲和力和高特异性，有望成为抗体候选药物，同时可用于后续中和表位鉴定，对NoV新型表位疫苗设计和抗体药物研发具有重要意义。