归芪白术方含药血清对胃癌MKN-45细胞增殖和IL-17、NF-κB表达的影响①

苏韫 李春波 龚红霞 薛轩 李婷婷 牛世伟（甘肃中医药大学基础医学院，兰州730000）

胃癌是胃肠道最严重的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围内分别居于第五位和第三位［1］。临床上胃癌的治疗方式以手术为主，化疗为辅。然而化疗不仅毒副反应明显，还会降低机体免疫力，影响化疗进程［2］。目前，中医药辅助治疗胃癌被广泛关注，其在防治肿瘤方面有着独特的优势。

中医将胃癌归属于“胃痛”“反胃”“噎嗝”“癥瘕积聚”等范畴［3］。中医认为，胃癌患者大多脾胃不和，健运失常，且历经手术及化疗，脾胃失调，气血亏虚，肝肾亏损，累及骨髓。治疗应以补益气血、健脾和胃、滋补肝肾为先［4-5］。归芪白术方是由明朝朱棣等著的《普济方》中的“黄芪汤”加白术而成。黄芪汤主治一切疮肿疼痛，并结合胃癌术后化疗气滞血瘀、脾虚湿困病证特点，具有攻补兼顾、扶正祛邪的特点，诸药共奏健脾益气、化瘀疏肝、润肠通便功效。课题组前期临床研究发现，归芪白术方辅助治疗不仅对胃癌患者的血清肿瘤标志物、免疫炎症因子及生活质量具有明显改善作用，可以升高患者机体白细胞（white blood cell，WBC）、中性粒细胞（neu‑trophil，Neu）、淋巴细胞（lymphocyte，Lym）、红细胞（red blood cell，RBC）和血小板（platelet，PLT），减轻化疗药物对机体肿瘤免疫应答带来的影响，还可改变患者肠道菌群及血清环状RNA（circRNA）的表达［6-7］。

胃癌是一个多种因素综合作用的过程，其中炎症是其重要的一环。长期的慢性炎症可损伤胃黏膜，进而发展成胃癌［8］。IL-17是一种前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子。通过与IL-17受体（IL-17R）特异性结合，促进多种细胞生成并释放出炎症因子。NF-κB信号通路作为重要的炎症信号通路，激活后参与机体感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡等病理过程，且与胃癌的发生发展密切相关［9］。因此，研究IL-17/NF-κB信号通路对于胃癌的机制探讨具有理论意义。本实验通过IL-17/NF-κB信号通路，研究归芪白术方含药血清对胃癌MKN-45细胞增殖的影响，探讨归芪白术方辅助治疗胃癌的作用机制，为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂胃癌MKN-45细胞，传至4~5代；雄性SD大鼠25只，体重180~220 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，SPF级，饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。符合甘肃中医药大学伦理委员会指导原则与要求。动物合格许可证号：SYXK（甘）2015-0005。DMEM培养基，0.25%胰酶，胎牛血清，细胞增殖检测（CCK-8）试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，4×蛋白上样缓冲液购于北京索莱宝生物科技有限公司；单克隆抗体（IL-17、IKK-β、p-NF-κBp65）购于GeneTex公司；IL-6、NF-κBp65购于Immunoway公司）；逆转录试剂盒，荧光定量试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；黄芪、当归、白术、白芍、大黄（酒）、陈皮、甘草，均购自甘肃中医药大学附属医院中药房。

1.1.2 主要仪器蛋白印迹电泳仪、CFX 96型实时荧光定量聚合酶链式反应仪、VELOCITY 18R型台式高速冷冻离心机、酶标仪、P100+型超微量分光光度计、Chemi Doc XRS凝胶成像分析系统购于美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 归芪白术方药液制备归芪白术方由黄芪20 g、当归10 g、白术10 g、白芍10 g、大黄（酒）6 g、陈皮6 g、甘草6 g组成。先用冷水浸泡中药30 min，再加入1 000 ml蒸馏水中煎煮，大火烧开后用小火煮30 min，过滤药液留存，把前后2次药液合并浓缩至生药质量浓度6.12 g/ml，使用时倍比稀释。4℃保存备用。

1.2.2 归芪白术方含药血清的制备及分组将25只雄性SD大鼠随机分为归芪白术方高、中、低剂量组、空白组和阳性药组。参考李康乐［10］、林德荣［11］、余婧萍［12］等的给药方法制备归芪白术方含药血清。设置归芪白术方高、中、低剂量分别为6.12 g/ml、3.06 g/ml、1.53 g/ml，空白组给予生理盐水灌胃3 d，每天上午下午各灌胃1次，每次3 ml；阳性药组按照奥沙利铂浓度15 mg/kg腹腔注射，每天2次。第3天最后1次灌胃、注射结束1 h，麻醉后腹主动脉取血，离心后取血清，滤膜过滤，56℃水浴灭活，-20℃保存备用。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖将对数期生长的细胞接种到96孔板中，每孔约1 000个细胞。归芪白术方高、中、低剂量组分别在完全培养基中加入相应10%含药血清，分别培养24 h、48 h、72 h后更换完全培养基100µl，每孔加入CCK-8 10µl，CO2培养箱中继续培养4 h，全波长酶标仪450 nm处测吸光度（A），计算平均值，细胞増殖抑制率（%）=［（A空白组-A加药组）/A空白组］×100%。

1.2.4 Western blot检测相关蛋白表达各组分别在完全培养基中加入相应10%含药血清，干预细胞48 h后，提取细胞蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，-20℃保存备用。取等量蛋白进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，转膜，封闭2 h，TBST洗膜10 min×3次，按照说明书使用要求加入一抗稀释液，于4℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次后，加入二抗稀释液在室温下摇床孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次后曝光。使用Image J软件对蛋白条带进行灰度值计算，与内参比较，分析相对蛋白表达。

1.2.5 Real-time PCR检测相关mRNA表达各组分别在完全培养基中加入相应10%含药血清，干预细胞48 h，提取总RNA，反转录为cDNA。进行PCR反应，反应条件：预变性95℃5 min，变性95℃10 s，退火60℃20 s，延伸72℃20 s，共循环40次。运用相对表达量2-ΔΔCt法进行数据分析。引物由兰州科宝生物工程大连科技有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学处理采用SPSS22.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。若方差齐采用LSD进行组间多重比较；若方差不齐采用Dunnett-T3进行组间多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 归芪白术方含药血清对MKN-45细胞增殖的影响归芪白术方含药血清分别干预MKN-45细胞24 h、48 h、72 h，与空白组比较，归芪白术方含药血清高、中、低剂量组吸光度值均下降，抑制率均上升，且随浓度及时间增加，各组细胞生长均受到抑制（P<0.05）。结果表明归芪白术方含药血清能抑制MKN-45细胞的增殖，且呈时间和剂量依赖性增加。见表2。

表2 归芪白术方含药血清对MKN-45细胞增殖的影响（±s）Tab.2 Effect of serum containing Guiqibaizhufang on MKN-45 cell proliferation（±s）

表2 归芪白术方含药血清对MKN-45细胞增殖的影响（±s）Tab.2 Effect of serum containing Guiqibaizhufang on MKN-45 cell proliferation（±s）

Note：Compared with blank group，1）P<0.05.

?

2.2 归芪白术方含药血清对MKN-45细胞中IL-17、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β和IL-6蛋白表达的影响Western blot结果表明，与空白组比较，阳性药组和归芪白术方高、中、低剂量含药血清组IL-17、NFκBp65、p-NF-κBp65、IKK-β和IL-6蛋白表达均减少（P<0.05），其中，归芪白术方含药血清中、高剂量组较为明显，见图1、表3。

表3 IL-17、IL-6、IKK-β、NF-κBp65及p-NF-κBp65的表达（±s）Tab.3 Expression of IL-17，IL-6，IKK-β，NF-κBp65 and p-NF-κBp65（±s）

表3 IL-17、IL-6、IKK-β、NF-κBp65及p-NF-κBp65的表达（±s）Tab.3 Expression of IL-17，IL-6，IKK-β，NF-κBp65 and p-NF-κBp65（±s）

Note：Compared with blank group，1）P<0.05.

?

图1 IL-17、IL-6、NF-κBp65、pNF-κBp65、IKKβ在各组中的表达Fig.1 Expressions of IL-17，IL-6，NF-κBp65，pNF-κBp65，IKK-β in each group

2.3 归芪白术方含药血清对MKN-45细胞中IL-17、NF-κBp65、IKK-β和IL-6 mRNA表达的影响结果显示，与空白组比较，阳性药组和归芪白术方高、中、低剂量含药血清组IL-17、NF-κBp65、IKK-β和IL-6 mRNA表达明显均下降，差异具有统计学意义（P<0.05），见表4、图2。

表4 IL-17、IL-6、IKK-β及NF-κBp65 mRNA的相对定量表达Tab.4 Relative quantitative expression of IL-17，IL-6，IKK-β and NF-κBp65 mRNA

图2 IL-17、IL-6、IKK-β及NF-κBp65 mRNA在各组细胞的相对定量表达Fig.2 Relative quantitative expression of IL-17，IL-6，IKK-β and NF-κBp65 mRNA in cells of each group

3 讨论

慢性胃炎被认为是胃癌的关键因素之一。近年来，随着炎症与肿瘤的深入研究，慢性胃炎的“炎-癌转化”模式已成为研究的热点［13-14］。因此有效地抑制慢性胃炎向胃癌的进展是关键所在。IL-17是近几年新发现的促炎细胞因子［15-16］。由辅助性T细胞（Th17）特异性分泌，主要表达在激活的CD4+T淋巴细胞［17］。IL-17可诱导早期免疫介质的分泌，使炎症细胞聚集到损伤部位。IL-17在胃癌发生发展的过程中起促进的作用。研究发现胃癌组血清IL-17水平明显高于健康对照组［18］。陈锦霞等［19］研究表明IL-17在胃癌组织中表达显著增高。前期本课题组研究也同样表明，不论是胃癌患者的血清中还是癌组织中IL-17的含量均明显升高［20］。当发生炎症反应时，IL-17可与细胞表面的IL-17R特异性结合，激活IκB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B ki‑nase，IκK），从而导致IκB蛋白磷酸化、泛素化，然后IκB蛋白被降解，NF-κB二聚体得以释放，NF-κB二聚体通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，并转移到细胞核中，与目的基因结合，以促进目的基因的转录，参与多种病理生理过程的调控，包括炎症反应、细胞增殖与凋亡、上皮-间质转化及血管生成，在胃癌的发生发展过程中起着重要作用［21］。研究表明IL-17通过NF-κB途径上调MMP2和MMP9的表达来促进胃癌细胞的侵袭［22］。宋静静等［23］研究发现IL-17可明显促进SGC7901细胞分泌IL-6和IL-8，并且通路蛋白NF-κB的表达水平及其磷酸化水平均明显升高，表明IL-17可能通过激活NF-κB信号通路来促进IL-6和IL-8的分泌，改变肿瘤的炎性微环境，促进胃癌细胞的迁移和侵袭，进而影响肿瘤的进展。前期本课题组通过实验检测了胃癌患者与健康对照组血清免疫因子IL-6、IL-17、IL-8的表达水平及胃癌患者胃癌组织、癌旁组织及远离癌组织的正常胃组织中NF-κB通路相关蛋白NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β、IL-6的表达水平，结果显示IL-17、IL-6、IL-8在胃癌患者血清中的表达水平较健康人群高；胃癌组织中IL-17、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β、IL-6蛋白表达较高［20］。表明IL-17可通过NF-κB信号通路分泌IL-6及IL-8，使其发生转录，促进肿瘤细胞的产生，从而参与胃癌的免疫调控以及促进胃癌的发生发展。

中医将胃癌归属于“胃痛”“反胃”“噎嗝”“癥瘕积聚”等范畴。中医认为胃癌的病机为本虚标实，虚实夹杂，其中正气不足为根本原因，复加邪气阻滞机体，产生气滞、痰凝、热毒、血瘀等病理变化，日久酿为癌毒［24］。这与《黄帝内经》中“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”的观点一致。故“扶正”是治疗胃癌的根本，以补气健脾为主。归芪白术方根据明•朱棣等《普济方》等医著“黄芪汤”化裁而来，由黄芪、白术、当归、白芍、陈皮、酒大黄、甘草7味药组成，7味药均归脾经，具有健脾益脾的功效。马榕［25］对近10年间中医治疗胃癌术后方药文献进行统计，高频用药频次分布前10位依次是甘草、茯苓、白术、党参、陈皮、黄芪、白芍、半夏、当归、白花蛇舌草。同时，大量实验研究证实，黄芪、当归、白术、陈皮相关组方、单药及其有效成分，对胃癌等荷瘤小鼠或相关细胞株具有显著抗瘤作用［26-27］。

目前，中药复方含药血清干预肿瘤细胞的实验研究愈来愈多，孙振等［28］研究表明软坚护肝片含药血清能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移侵袭和上皮-间质转化，发挥抗肿瘤作用。益肺饮含药血清对肺癌A549细胞具有明显的增殖抑制、诱导凋亡的作用［29］。柴胡疏肝散含药血清可抑制乳腺癌MCF-7细胞VEGF释放，有效抑制MCF-7细胞增殖活性［30］。郭隽馥等［31］研究表明益气健脾方药四君子汤的含药血清能够有效抑制胃癌MGC803细胞的增殖能力并提高其凋亡率。林德荣等［11］研究表明扶正抑瘤汤含药血清可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，促进其凋亡。黄丽萍等［26］研究发现加味七方胃痛颗粒能抑制SGC 7901的增殖并促进其凋亡，可能通过下调胃癌细胞TFF3、ERK/NF-κB蛋白的表达水平，从而起到抗癌作用。

本研究严格按照参考文献制备含药血清，干预胃癌MKN-45细胞，通过本实验结果分析发现，归芪白术方含药血清可以明显抑制MKN-45细胞的增殖，进而影响MKN-45细胞的生长。归芪白术方含药血清干预下，与空白组比较，归芪白术方含药血清高、中、低剂量组光度值均下降，抑制率均上升，且随浓度及时间增加，各组细胞生长均受到抑制。归芪白术方含药血清高、中、低剂量组IL-17、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKK-β和IL-6蛋白表达降低；IL-17、NF-κBp65、IKK-β和IL-6 mRNA表达明显均下降；其中以中、高剂量较为明显。表明归芪白术方含药血清能抑制MKN-45细胞的增殖，且呈时间和剂量依赖性增加，其机制可能与IL-17/NF-κB信号通路有关。

本实验基于IL-17/NF-κB信号通路探讨归芪白术方治疗胃癌的分子机制，为临床应用提供了一定的实验支持。但是，胃癌发病机制复杂，涉及多条通路、多靶点的共同作用，本课题组将在进一步的实验中，探索新方法，进一步完善其机制。