miR-1204靶向调控DEK蛋白对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响及作用机制研究

蒋 慧 邵乐健 杨树坤 宋 瑞（皖北煤电集团总医院呼吸内科，宿州234000）

肺癌是全球范围内发病率较高和死亡速度较快的原发性恶性肿瘤，严重威胁人类生命和身体健康［1-2］。非小细胞肺癌约占肺癌的80%，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，癌细胞生长分裂较快，且扩散转移较早［3］。非小细胞肺癌早期症状为发热、咳嗽、胸痛等，多数患者因以上初期症状被误诊，约75%患者发现时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机［4］。非小细胞肺癌临床治疗方法以手术为主，以放化疗、中药治疗为辅，但患者生存率仍然较低。靶向治疗逐渐成为研究热点，为非小细胞肺癌治疗提供了新思路。miR-1204异常表达与肿瘤发生发展密切相关。DEK蛋白是高度保守的转录调控因子，被确认为是一种癌基因，其过表达已被证实与多种人类恶性肿瘤相关，可作为肿瘤治疗靶点［5］。本文旨在研究miR-1204靶向调控DEK蛋白对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响及作用机制，为非小细胞肺癌靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人非小细胞肺癌细胞株（中国医学科学院肿瘤细胞库）；兔抗大鼠Bak抗体（Invitrogen公司）；大鼠抗小鼠Bcl-2抗体（Dako公司）；兔抗小鼠caspase-7抗体（Selleck公司）；兔抗人DEK抗体（武汉博士德生物）；BCA蛋白定量试剂盒、MTT试剂盒（天根生化）；磷酸盐缓冲液、胎牛血清、DMSO（北京中杉金桥）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 采用含10%胎牛血清的培养液培养人非小细胞肺癌细胞株，培养条件为37℃、5%CO2，85%融合时传代。

1.2.2 慢病毒载体构建及分组 根据质粒特点设计miR-1204引物序列，引入SacⅠ酶切位点，F：5'-UCGUGGCCUCCUCUCCAUUAU-3'，R：5'-AGCACCGGACCAGAGGUAAUA-3'，由宝生物工程（大连）有限公司合成，将正反链混合后加入退火缓冲液，94℃反应4 min，冷却至室温，生成双链。采用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1，将退火产物100倍稀释后与其连接，22℃孵育过夜，采用大肠杆菌DH5α转化，第2天采用单克隆菌落接种于30 μg/ml Kana的LB培养液，200 r/min离心，37℃振动混合过夜。抽提少量质粒，采用SacⅠ酶切鉴定（上海生工生物工程技术服务有限公司完成），分为空白组、miR-1204上调组和miR-1204下调组，重悬，分别加入4 μg生理盐水、pcDNA3.1-miR-1204、miR-1204siRNA，电击，室温存放120 min，将各组细胞加入6孔、96孔板，培养箱内培养，加入含800 μg/ml G418的培养基再次培养。

1.2.3 ELISA检测DEK表达 将待检细胞采用胰酶消化后制成细胞悬液。50 mmol/L碳酸盐稀释抗DEK，置于聚苯乙烯反应孔，4℃放置24 h，次日洗涤3次，甩干，各孔中加入稀释液稀释的待测标本0.1 ml，同时加入阴性阳性的对照标本，45℃放置60 min，洗涤3次，移除液体，各孔中加入0.1 ml DEK酶标抗体，45℃放置60 min，洗涤3次，移除液体，各孔中加入0.1 mol/L Na2HPO4和0.05 mol/L枸橼酸混匀，加入0.1 ml邻苯二胺，遮光保存20 min，加入0.05 ml H2SO4（2 mol/L）终止反应，酶标仪检测DEK水平。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 将待测细胞置于96孔板，12 h、24 h、72 h后加入MTT溶液常温孵育4 h，加入DMSO，酶标仪检测波长497 nm处各孔OD值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将培养好的细胞用磷酸盐缓冲液清洗3次，各组取样本细胞加入5 μl AnnexinV染液和10 μl碘化丙啶染液，常温避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期分布 将培养好的细胞用70%乙醇溶液固定，4℃保存过夜，离心5 min去除固定液，磷酸盐缓冲液清洗3次。加入100 μl RNA酶（100 μg/ml），常温保存30 min，加入100 μl碘化丙啶染色液，低温避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.2.7 Transwell小室实验细胞侵袭、迁移情况 细胞侵袭情况：实验开始前2 h湿化小室，上室加入细胞悬液200 μl，下室加入含10%胎牛血清的细胞培养液培养24 h，PBS冲洗2次，4%多聚甲醛中放置30 min。细胞迁移情况：胰酶消化细胞制成细胞悬液，接种于6孔板，10枪尖垂直于孔板底部划直线，PBS缓冲液清洗3次，常温培养24 h，拍照，计算划痕。

1.2.8 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达

提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，离心10 min，取上清电泳5 min，10%牛奶封闭90 min。加入一抗孵育1 d，清洗，加入二抗孵育1 h，清洗，显色，检测细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料以±s描述，3组间比较采用F检验，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1204靶向调控DEK表达miR-1204下调组DEK表达高于空白组（P＜0.05）。miR-1204上调组DEK表达低于空白组、miR-1204下调组（P＜0.05，表1）。

表1 miR-1204靶向调控DEK表达（±s）Tab.1 miR-1204 targeting regulated DEK expression（±s）

表1 miR-1204靶向调控DEK表达（±s）Tab.1 miR-1204 targeting regulated DEK expression（±s）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 DEK 0.85±0.22 1.34±0.421）0.69±0.101）2）

2.2 各组非小细胞肺癌细胞增殖率、凋亡率比较miR-1204下调组细胞增殖率高于空白组（P＜0.05）；miR-1204上调组细胞增殖率低于空白组、miR-1204下调组（P＜0.05）。miR-1204下调组细胞凋亡率低于空白组（P＜0.05）；miR-1204上调组细胞凋亡率高于空白组、miR-1204下调组（P＜0.05，表2）。

表2 各组非小细胞肺癌细胞增殖率、凋亡率比较（±s，%）Tab.2 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of NSCLC cells in each group（±s，%）

表2 各组非小细胞肺癌细胞增殖率、凋亡率比较（±s，%）Tab.2 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of NSCLC cells in each group（±s，%）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 Proliferation rate 24 h 47.23±5.07 53.39±6.471）40.02±5.341）2）48 h 50.87±5.15 59.52±6.631）33.11±4.271）2）72 h 53.14±5.23 65.29±6.691）20.94±3.751）2）Apoptosis rate 24 h 24.18±5.06 20.39±5.171）25.02±5.341）2）48 h 26.83±4.75 23.12±5.611）33.11±4.271）2）72 h 29.14±5.23 25.02±4.391）40.94±5.751）2）

2.3 各组非小细胞肺癌细胞周期分布情况比较miR-1204下调组细胞处于G1期的比例高于空白组（P＜0.05）；miR-1204上调组细胞处于G1期的比例低于空白组、miR-1204下调组，（P＜0.05，表3）。

表3 各组非小细胞肺癌细胞周期分布情况比较（±s，%）Tab.3 Comparison of cell cycle distribution of NSCLC in each group（±s，%）

表3 各组非小细胞肺癌细胞周期分布情况比较（±s，%）Tab.3 Comparison of cell cycle distribution of NSCLC in each group（±s，%）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 G1 22.25±4.12 25.35±3.831）20.67±3.511）2）S 26.95±3.08 30.49±3.751）17.34±2.161）2）G2 29.11±2.93 38.32±3.251）12.24±2.181）2）

2.4 各组细胞侵袭、迁移能力比较 空白组、miR-1204上调组侵袭细胞数明显多于miR-1204下调组（P＜0.05）；空白组与miR-1204上调组迁移细胞数明显少于miR-1204下调组（P＜0.05，表4、图1）。

表4 细胞侵袭、迁移情况（±s，%）Tab.4 Cell invasion and migration（±s，%）

表4 细胞侵袭、迁移情况（±s，%）Tab.4 Cell invasion and migration（±s，%）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 Invasive cells number 63.87±12.59 82.64±16.751）51.66±9.851）2）Migrating cells number 66.72±11.37 79.66±13.551）55.67±8.761）2）

2.5 各组细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表达 如表5、图2所示，miR-120下调4组细胞Bcl-2、caspase-9蛋白表达高于空白组，Bak蛋白表达低于空白组（P＜0.05）；miR-1204上调组细胞Bcl-2、caspase-9蛋白表达低于空白组、miR-1204下调组，Bak蛋白表达高于空白组、miR-1204下调组（P＜0.05）。

表5 各组细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表达（±s）Tab.5 Expressions of apoptosis related proteins Bak，Bcl-2 and caspase-9 in each group（±s）

表5 各组细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9表达（±s）Tab.5 Expressions of apoptosis related proteins Bak，Bcl-2 and caspase-9 in each group（±s）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05；compared with down-regulated miR-1204 group，2）P＜0.05.

Groups Blank Down-regulated miR-1204 Up-regulated miR-1204 Bak 1.02±0.14 0.73±0.121）1.39±0.221）2）Bcl-2 1.18±0.19 1.44±0.231）0.71±0.111）2）caspase-9 0.94±0.15 1.16±0.181）0.62±0.101）2）

图2 Bak、Bcl-2、caspase-9表达Fig.2 Expressions of Bak，Bcl-2 and caspase-9

3 讨论

非小细胞肺癌是肺原发性恶性肿瘤，位居我国城市人口恶性肿瘤死亡原因第一［6］。EGRF络氨酸激酶抑制药使分子靶向治疗进入人们的视野，为非小细胞肺癌个体化治疗注入了新的生命［7］。各类靶向药物研究层出不穷，寻找有效治疗靶点对非小细胞肺癌治疗至关重要。研究证明，微小RNA（miRNA）参与多种复杂生物过程，具有组织特异性，其功能可根据靶基因作用不同调控肿瘤发生发展，具有癌基因或抑癌基因作用，可作为肿瘤诊断生物标志物［8］。

miR-1204由非蛋白编码PVTI基因座编码，对相关基因具有负调控作用，参与多个复杂生物学过程，在细胞增殖和凋亡中发挥作用［9-10］。DEK蛋白普遍存在于部分蛋白及多细胞生物中，在急性髓系白血病亚型中以DEK-CAN融合蛋白形式分离，在结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中呈高表达，与肿瘤发生发展密切相关。刘双萍等［11］研究发现，DEK蛋白检测可作为宫颈癌细胞增殖指标之一，有望成为宫颈癌治疗的新靶点。本研究显示，miR-1204上调组DEK蛋白表达较低，说明上调miR-1204可降低DEK蛋白表达，对DEK具有靶向调控作用。

非小细胞肺癌细胞异常增殖可不断产生新的癌细胞，促进疾病发展。郭智慧等［12］研究认为，Notch1靶向调控DEK基因可显著抑制癌细胞增殖，抑制乳腺癌发展，提示靶向作用于DEK基因对癌细胞具有抑制效果。本研究显示，miR-1204上调组12 h、24 h、72 h非小细胞肺癌细胞增殖率降低，说明上调miR-1204可降低DEK基因表达，抑制癌细胞增殖。

细胞周期分为3个阶段：DNA合成前期（G1）、合成期（S）、合成后期（G2），S期是细胞分裂增殖的关键时期，将细胞阻滞于S期之前可有效抑制癌细胞发展［13］。李伟伟等［14］研究发现，siRNA靶向调控DEK基因可改变癌细胞周期分布。本研究显示，miR-1204上调组非小细胞肺癌细胞处于G1期的比例相对较高，说明上调miR-1204可降低DEK基因表达，改变肿瘤细胞周期分布。

非小细胞肺癌发生发展与肿瘤组织细胞不断侵袭、迁移密切相关，抑制癌细胞侵袭、迁移能力是抑制非小细胞肺癌发展的关键。本研究显示，上调miR-1204表达的非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移细胞数相对较少，说明上调miR-1204表达可抑制非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移，抑制肿瘤组织发展、扩散。

细胞异常凋亡与细胞异常增殖密切相关，细胞凋亡是细胞主动性凋亡过程，与多种凋亡相关因子相互作用有关［15-16］。caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白等在凋亡信号中扮演重要角色［17-18］。Bcl-2家族蛋白分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白2类，Bak属于促凋亡蛋白，Bcl-2属于抗凋亡蛋白；caspase-9属于凋亡执行因子［19-20］。本研究显示，miR-1204上调组12 h、24 h、72 h非小细胞肺癌细胞凋亡率升高，且miR-1204上调组细胞Bcl-2、caspase-9蛋白表达降低，Bak蛋白表达升高，说明上调miR-1204可降低DEK基因表达，通过调控细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase-9相对表达促进非小细胞肺癌细胞凋亡，抑制肿瘤发展。

综上所述，miR-1204上调可降低DEK表达，通过调控Bak、Bcl-2、caspase-9表达抑制细胞增殖，阻滞细胞周期分布，促进细胞凋亡。