谷红注射液有效成分介导eNOS与LOX-1对冠状动脉内皮细胞损伤的影响

魏艳胜，张永春，黄陆力，王学惠，张俊彪，刘辉

动脉粥样硬化（AS）是多种动脉闭塞疾病的病理基础，主要表现为内皮细胞损伤、脂质聚集、结缔组织增生和动脉粥样硬化斑块形成，保护内皮细胞完整性是预防AS的关键[1,2]。研究发现，凝素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）能通过激活氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）引发内皮细胞炎症和诱导其凋亡，抑制LOX-1表达能降低内皮细胞损伤[3]。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）有助于内皮细胞产生舒血管因子一氧化氮（NO），促进eNOS表达降低血管硬度，抑制AS进程[4]。谷红注射液2005年批准为临床心血管疾病治疗药物，与其活性成分羟基红花黄色素A（HSYA）的抗凝血、血管舒张、抗炎等作用密切相关[5,6]。目前关于HSYA在内皮细胞损伤中作用及机制尚不明确，本研究通过在体外模拟AS发生过程，分析HSYA是否通过影响eNOS、LOX-1表达，从而参与冠状动脉（冠脉）内皮细胞的损伤修复，以期为临床诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料HSYA溶液液配制：取0.9 mg HSYA（北京索来宝生物科技有限公司）溶解于生理盐水中，加入RPMI-1640稀释到浓度分别为1、10、100 μmol/L的溶液。实验试剂：ox-LDL购自Sigma-Aldirich公司，LOX-1、eNOS、β-action抗体试剂盒购自美国Santa Cruz公司，乳酸脱氢酶（LDH）、一氧化氮（NO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，青链霉素、胎牛血清（FCS）、RRMI-1640购自美国Gibco公司，CCK-8检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。实验仪器：CO2培养箱（美国Thermo公司3111型），酶标仪（美国BioTek公司MPR-A100型）。

1.2 细胞培养在加入青链霉素的10% FCS RRMI-1640培养基中培养，培养条件：37℃，5%CO2，95%饱和湿度。待细胞长满培养皿80%加入20 μg/ml ox-LDL刺激为模型组，采用不同浓度（1、10、100 μmol/L）HSYA刺激24 h后继续培养，并分别作为低、中、高HSYA组，另选未处理的HCAECs细胞为对照组，正常培养24 h。

1.3 CCK8法检测细胞存活率水平在细胞培养24 h时，各组分别加入10 μl CCK8试剂37℃避光孵育2 h，加入150 μl DMSO溶解在490 nm处测定吸光度值，以对照组为参照，计算各组细胞存活率，重复操作3次取平均值。

1.4 采用硝酸盐还原法和乳酸脱氢酶比色法检测细胞培养液中NO、LDH含量取试剂盒，制作标准曲线，收集各组细胞培养液，取出96孔板，每孔中分别加入50 μl的标准品、样品、Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ，室温孵育5 min，在540 nm处采用酶标仪测定吸光度，依据标准曲线计算待测细胞液中NO含量。LDH含量按试剂盒说明书操作，在450 nm处测定吸光值，与标准曲线对比测定LDH含量。

1.5 RT-PCR检测LOX-1、eNOS的mRNA表达量加入Trizol试剂提取总RNA，测定浓度后取5 μl逆转录为cDNA，以cDNA为模板在PCR仪（LightCycler 480型）上进行定量检测，LOX-1引物：上游5'-GAGAGTAGCAAA TTG TTCAGCTCCTT-3'，下游5'-GCCCGAG GAAAATAGGTAACAGT-3'；eNOS：上游，5'-TCT CCGCCTCGCTCAT-3'，下 游5'-AGCC ATACAGGATTGTCGCC-3'；GAPDH引物：上游5'- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游:5'-'TGTAGA CCATGTA GTTGAGGTCA-3'。计算待测基因相比对照组细胞中表达改变的倍数，结果以2-△△Ct表示为LOX-1、eNOS的mRNA的相对表达量。

1.6 Western blot检测LOX-1、eNOS蛋白表达量收集培养48 h时各组细胞并加入细胞裂解液提取细胞中总蛋白，测定蛋白浓度合格后采用SDSPAGE分离并检测各蛋白表达水平，先恒压80 V 0.5 h，随后120 V电泳45 min，经转膜、封闭、加一抗、加二抗后采用凝胶成像系统检测目的蛋白条带表达水平，内参蛋白为β-action，计算结果为LOX-1、eNOS蛋白相对表达量。

1.7 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件包对数据进行统计分析，符合正态分布计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HCAECs细胞存活率比较CCK8检测结果显示，培养24 h时各HAYA处理组细胞存活率均高于模型组、低于对照组，且HAYA浓度越高细胞存活率越高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1，图1）。

图1 各组HCAECs细胞存活率比较

表1 各组细胞存活率比较

2.2 各处理组细胞培养液中NO、LDH量比较培养24 h时各HAYA处理组细胞培养液中NO含量均高于模型组、低于对照组，LDH含量低于模型组、高于对照组，且HAYA浓度越高NO含量越多，LDH含量越低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 各组细胞培养液中NO、LDH量比较

2.3 各组细胞LOX-1、eNOS的mRNA相对表达量RT-PCR检测结果显示，培养24 h时各HAYA处理组eNOS mRNA相对表达量均高于模型组、低于对照组，LOX-1mRNA表达量低于模型组、高于对照组，且HAYA浓度越高eNOS mRNA量越多，LOX-1mRNA表达量越低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 各组细胞LOX-1、eNOS的mRNA相对表达量

2.4 各组细胞LOX-1、eNOS蛋白相对表达量Western blot检测结果显示，培养24 h时各HAYA处理组eNOS蛋白相对表达量均高于模型组、低于对照组，LOX-1蛋白表达量低于模型组、高于对照组，且HAYA浓度越高eNOS 蛋白表达量越多，LOX-1蛋白表达量越低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表4，图2）。

图2 Western blot检测各组LOX-1、eNOS蛋白表达条带

表4 各组细胞LOX-1、eNOS的mRNA相对表达量

3 讨论

谷红注射液主要成分为红花，具有活血祛瘀、通经止痛功效，在多种心血管疾病中广泛使用[7,8]。HSYA是实验室中用于对红花进行质控的主要有效成分，研究发现，HSYA可能通过信号通路参与HCAECs细胞损伤修复，阻止心血管疾病进程[9]。我们通过检测不同浓度HSYA对HCAECs细胞损伤及相关损伤物质表达影响，分析其作用机制。

LDL经氧化形成ox-LDL是AS发生的重要事件，采用ox-LDL刺激HCAECs细胞诱导细胞损伤模型，模拟AS进程[10]。研究发现，培养24 h时各HAYA处理组细胞存活率均高于模型组、低于对照组，且HSYA浓度越高细胞存活率越高，提示采用ox-LDL诱导可模拟AS过程，引发HCAEC细胞存活率下降，而采用HSYA处理能降低ox-LDL对细胞损伤，该作用随HASY浓度增加（1、10、100 μmol/L）而增强。已有研究发现HASY对HCAECs细胞损伤具有促修复作用[11]，与本研究结果一致，但作用机制不明。HCAECs细胞功能障碍是AS发生的早期标志事件，机体表现为持续的炎症反应和NO产生不足。NO是HCAECs细胞分泌的舒血管因子，对维持HCAECs细胞结构完整和功能稳定起关键作用，当HCAECs细胞受损时，NO合成和分泌明显不足，表现为含量下降[12]。LDH是胞浆中的一种性质较为稳定的酶，当HCAECs细胞发生破坏时，LDH大量释放到培养基中，通过检测细胞培养液中NO、LDH水平变化可判断HCAECs细胞损伤情况[13]。本研究发现，培养24 h时各HAYA处理组细胞培养液中NO含量均高于模型组、低于对照组，LDH含量低于模型组、高于对照组，且HAYA浓度越高NO含量越多，LDH含量越低，提示HCAECs细胞受损后培养基中NO减少、LDH增多，进一步证实了采用HAYA处理能减少HCAECs细胞程度，提高NO合成量和降低LDH的外流。eNOS是HCAECs细胞分泌的NO合酶，作用于NO扩散到平滑肌细胞激活cGMP，促进血管舒张，eNOS含量降低提示NO合成减少，舒血管因子不足易推动AS进程[14]。ox-LDL是LOX-1的激活剂，在正常条件下LOX-1表达水平降低，但在氧化应激反应、炎症刺激下，ox-LDL表达上调且参与了HCAECs细胞降解过程[15]。本研究中在分子生物学水平上分析了各组eNOS、LOX-1表达情况，结果显示，培养24 h时各HAYA处理组eNOS mRNA及蛋白相对表达量均高于模型组、低于对照组，LOX-1mRNA及蛋白表达量低于模型组、高于对照组，且HAYA浓度越高eNOS mRNA及蛋白表达量越多，LOX-1mRNA及蛋白表达量越低，提示HSYA对HCAECs细胞损伤具有保护作用，可促进HCAECs细胞结构和功能修复。此外研究发现，HSYA可抑制平滑肌细胞的增殖和新血管生成，这也是冠心病患者PCI术后发生支架再狭窄的主要机制[16]。HSYA具有促进内皮细胞修复和平滑肌细胞增殖迁移的双重功效，对抑制冠心病患者AS进展及术后支架再狭窄、缩短术后抗凝时间等具有重要意义[17]。临床中通过将HYSA与雷帕霉素等抑制平滑肌细胞增殖的药物洗脱支架涂层制成混合涂层，可能在抑制平滑肌细胞增殖、促进HCAECs快速修复、降低PCI术后狭窄率等方面发挥较大作用[18]。

综上所述，谷红注射液对心血管疾病的治疗作用可能是通过其有效成分HSYA抑制HCAECs细胞损伤并促进其修复及提高存活率来实现的，为AS相关心血管疾病预防、诊疗及冠心病术后再狭窄等方面提供潜在治疗方向。