高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素含量的不确定度评价探讨

古汶玉，钟国才，邓常继，黄 玉，何咏怡

（广东省粮食科学研究所，广州 510000）

脱氧雪腐镰刀烯醇，俗称呕吐毒素，是一种来源于镰刀菌属产生的单端孢霉烯族毒素[1]。呕吐毒素污染粮食的情况严重，主要污染小麦、玉米等谷物。人和动物在食用被该毒素污染的食物后，会导致各类急性中毒症状，如恶心、腹泻、呕吐等，严重时还会导致造血系统受损而死亡，对人和动物的健康造成很大威胁，也对农业经济造成严重损失[2]。因此，准确测量小麦中的呕吐毒素含量具有重要意义。本实验采用GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》规定的方法测定小麦中呕吐毒素含量[3]，以不确定度为指标，依据JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》[4]及CNASGL06-2006《化学分析中不确定度的评估指南》[5]的要求对实验过程中产生的不确定度进行评估计算，为评估检测结果的质量水平和改进实验操作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦，2020年委托检测小麦样品。

呕吐毒素标准品GBW(E)100304:纯度99%，国家粮食和物资储备局科学研究院；呕吐毒素质控样GBW(E)100382，国家粮食和物资储备局科学研究院；呕吐毒素免疫亲和柱，青岛普瑞邦生物工程有限公司；甲醇：色谱纯，德国Meker公司。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪：配有紫外检测器，美国Agilent公司；ML-3002型分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；涡旋振荡器，德国Hei-dolph公司；BLH-56K型粉碎机，浙江伯利恒仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将小麦样品用高速粉碎机粉碎，过0.5～1 mm孔径试验筛，从筛下物准确称取25 g试样于具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混匀，置于涡旋振荡器震荡20 min，10 000 r/min下离心5 min，移取上清液1 mL过免疫亲和柱。用5mL PBS缓冲盐溶液和5 mL去离子水分两次清洗，弃去全部流出液，抽干小柱后，用2.0 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液后用氮吹仪吹干，然后加入1.0 mL流动相复溶，涡旋混匀，经0.45 μm滤膜过膜，收集滤液于进样瓶中以备进样。

1.3.2 标准溶液的配制

准确吸取1.0 mL呕吐毒素标准品至10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度并充分混匀，再配制成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5 000 ng/mL的标准系列工作液，4℃保存，有效期7 d。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（15:15:70，V/V）；柱温 35 ℃；流速0.8 mL/min；进样量 50 μL；检测波长 218 nm。

2 结果与分析

2.1 结果计算

试样中呕吐毒素的含量按以下公式计算：

式中：X为试样中呕吐毒素的含量，其单位为μg/kg；C1为试样中呕吐毒素的质量浓度，其单位为ng/mL；C0为空白试样中呕吐毒素的质量浓度，单位为ng/mL；V为样品洗脱液的最终定容体积，单位为mL；f为样液稀释因子；1 000为换算系数；m为试样的称样量，单位为g。

2.2 不确定度来源

本测试方法的不确定度主要来自：样品非均匀性引起的不确定度；测量重复性引起的不确定度；测量回收率引起的不确定度；样品前处理引起的不确定度，包括天平引起的不确定度、25 mL量筒引起的不确定度；标准溶液配制过程中引起的不确定度，包括标准溶液质量浓度引起的不确定度、10 mL容量瓶引起的不确定度、1 000 μL移液器引起的不确定度、200 μL移液器引起的不确定度、100 μL移液器引起的不确定度。

2.3 不确定度的计算

2.3.1 样品非均匀性引起的不确定度

取小麦样品，经分样、制备得到6份小麦试样，分别测定含量，探究样品非均匀性引入的不确定度。测定结果见表1，其不确定度按A类评定。

2.3.2 测量重复性引起的不确定度

表2 样品重复测定检测结果

2.3.3 测量回收率引起的不确定度

对样品进行加标回收试验，得出结果如表3。

表3 样品加标回收率测定结果

则测量回收率标准偏差为：

2.3.4 样品前处理引起的不确定度

2.3.4.1 天平引起的不确定度

2.3.4.2 100 mL量筒引起的不确定度

2.3.4.3 由样品前处理引起的不确定度的合成

由样品前处理引起的2个不确定度分量ur4-1和ur4-2互不相关，其合成相对标准不确定度ur4采用平方和的平方根方法得到：

2.3.5 标准溶液配制过程中引起的不确定度

2.3.5.1 标准溶液质量浓度引起的不确定度

2.3.5.2 10 mL容量瓶引起的不确定度

2.3.5.3 1 000 μL移液器引起的不确定度

2.3.5.4 200 μL移液器引起的不确定度

2.3.5.5 100 μL移液器引起的不确定度

2.3.5.6 标准溶液配制过程中引起不确定度的合成

由标准溶液配制过程中引起的5个不确定度分量 ur5-1、ur5-2、ur5-3、ur5-4、ur5-5互不相关，其合成相对标准不确定度ur5采用平方和的平方根方法合成得到：

2.4 合成不确定度

各个分量的合成不确定度如表4所示，各不确定度分量相互独立，因此相对合成标准不确定度为：

表4 相对标准不确定度分量与合成不确定度

2.5 拓展不确定度

取95%的置信区间，扩展因子k=2，则扩展不确定度:U=uc××k=3.74×10-2×950×2=71 μg/kg。因此，本次呕吐毒素测得的含量为950±71 μg/kg。

3 结论

本实验对使用高效液相色谱法测定小麦中的呕吐毒素含量的不确定度进行了评定，通过评定可以得出，影响测量结果的不确定度主要有标准溶液配制过程中引起的不确定度，样品非均匀性引起的不确定度和测量重复性引起的不确定度，结果表明高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素的测量不确定度为:71 μg/kg。