HPV E6/E7 mRNA阳性而阴道镜检查阴性患者中漏诊HSIL及以上病变的危险因素分析*

罗燕艳，罗小婉，符丽华，尚雪，林钰叶

（中山市博爱医院 妇科，广东 中山 528403）

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。宫颈癌是可以通过早期筛查，尽可能发现癌前病变而将其阻断的一种恶性肿瘤。因此，很多研究均致力于如何最大程度漏诊宫颈癌前病变。研究表明，高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus,HR-HPV）持续感染宫颈细胞后，以整合形式存在于宿主细胞并大量转录癌基因E6、E7mRNA 并生成E6、E7 癌蛋白，通过失活p53 和pRb 发挥作用，使细胞的生长周期失控，从而引起真正的子宫颈癌前病变，如：高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial Lesions,HSIL）和子宫颈癌。因此，认为E6、E7 mRNA 表达提示病毒癌基因已经转录表达，可以用于评估子宫颈癌变的风险与发展趋势［1］。HAEDICKE等［2］发表的Meta 分析指出HPV E6/E7 mRNA 较HPV DNA 和细胞学能更有效的筛出宫颈病变≥宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）2 级以上的人群，从而降低过度治疗，可考虑在初筛中单独应用。本研究对HPV E6/E7 mRNA初筛阳性患者，进一步进行液基薄层细胞学检查（thinprep cytologic test,TCT）、HPV 分型检测、阴道镜检查及病理活检。对其中466 例阴道镜检查阴性患者经病理确诊为HSIL 及以上的病例进行分析，探讨这部分患者漏诊HSIL 及以上病变的危险因素，从而最大限度减少漏诊HSIL 及以上病例，降低宫颈癌的发生率。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018 年9 月至2020 年9 月在中山市参加政府宫颈癌筛查的女性，采集的宫颈分泌物统一送至中山市博爱医院实验室检查，将有完整病历记录的HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者共466 例纳入研究，年龄35～65 岁，平均（55.50±8.59）岁。纳入标准：①具有完整HPV E6/E7 mRNA、液基细胞学，阴道镜评估，宫颈病理活检和/或宫颈管搔刮术结果；②既往未行宫颈病变治疗史；③无其他肿瘤疾病治疗史及免疫缺陷者；④排除妊娠状态。排除标准：①子宫切除者；②资料不全者。所有阴道镜检查及活检、宫颈管搔刮术均获得患者知情同意，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 HPV E6/E7 mRNA 方法 所有采集标本用Thinprep 细胞保存液瓶保存，统一在中山市博爱医院实验室进行Aptima HPV E6/E7 mRNA PANTHER系统自动检测平台进行检测。按照说明书进行操作。针对14 种高危型HPV 亚型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）进行检测。结果分析根据分析物信号与阈值比（S/CO）进行判读，分为HR-HPV（+）及HRHPV（-），当检测结果无效时，需重新检测；当检测结果阳性时，行分型检测，分为HPV16、18/45、其他型别三组。

1.2.2 宫颈液基薄层细胞学检测 当HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性时，将保存液中剩余标本使用Thinprep 2000 制片系统制成液基薄层涂片后用95%乙醇固定，巴氏染色。由2 位高年资病理医师进行阅片。结果按国际癌症协会推荐TBS 系统（The Bethesda system）（2014）分类标准诊断进行报告，分为：未见上皮内病变或恶性病变（no intraepithelial lesions or malignant lesions,NILM）、意义不明的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US）、低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL）、HSIL、非典型鳞状细胞、不除外上皮内高度病变（atypical squamous cells-cannot exclude HSIL,ASC-H）、非典型腺上皮细胞（atypical glandular cells,AGC）和鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）。

1.2.3 阴道镜检查 由妇科阴道镜室专科医生参照2011 年国际子宫颈病理与阴道镜联盟（IFCPC）的阴道镜术语进行阴道镜图像的描述和诊断。充分暴露宫颈后，4%醋酸溶液下未见醋白上皮、异常血管等异常图像，随后涂抹5%Lugol 碘液不着色，阴道镜检查判读为阴性。

1.2.4 宫颈活检和/或宫颈管搔刮 对阴道镜检查阴性的患者，在阴道镜下对宫颈进行随机活检，活检点数为1～4 个。对于Ⅲ型转化区者加行宫颈管搔刮术（endocervical curettage,ECC）。

1.2.5 病理结果 阴道镜下活检的宫颈组织制片后采用苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE），由病理科医生进行阅片，并由1 个高年资病理科医生进行复核，病理结果分为炎症、LSIL、HSIL、宫颈癌（包括鳞癌、腺癌）。

1.3 统计学方法

通过SPSS 20.0 进行对数据进行分析，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验；采用二分类Logistic 回归分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者中检出HSIL 及以上病例情况

以病理为金标准，466 例HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者中检出42 例HSIL，检出率为9.01%（42/466）；腺癌1 例，检出率为0.21%（1/466）。

2.2 不同TCT 中检出HSIL 及以上病例情况

所有HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性患者均利用同一份标本保存液中剩余的标本进行了液基细胞学检查（TCT）。结果NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H、HSIL 分别为80.47%、13.95%、4.29%、0.43%、0.86%。以病理结果为金标准，随着TCT异常级别的升高（因ASC-H 例数少，不计入分析），HSIL 病例的检出率呈上升趋势，不同TCT结果中HSIL 及以上病例的检出率间的差异有统计学意义（χ2=14.440,P=0.002）。见表1。

表1 不同TCT 中检出HSIL 及以上病例情况 ［n(%)］

2.3 不同HPV 型别中检出HSIL 及以上病例情况

HPVE6/E7mRNA 阳性者进一步进行型别检查，分为16、18/45、其他型别三组，对其病理结果进行分析，结果表明，HPV16 型、18/45 型、其他型别中HSIL 及以上病例中检出率分别为14.89%（14/94）、8.57%（6/70）、7.62%（23/302），虽然HPV16 型中的检出率最高，但三组在检测HSIL 及以上病例中差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 不同HPV 型别中检出HSIL 及以上病例情况［n(%)］

2.4 不同年龄阶段中检出HSIL 及以上病例情况

进一步分析年龄是否为影响因素，以5 岁为一年龄阶段，结果表明，随着年龄的增长，组织学HSIL 及以上病例的检出率呈上升趋势，且差异有统计学意义（χ2=13.328,P=0.020）。见表3。

表3 不同年龄阶段中检出HSIL 及以上病例情况［n(%)］

2.5 HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者漏诊HSIL 及以上病例的危险因素分析

以组织学HSIL 及以上的病理结果为因变量，年龄、HPV 型别、TCT 结果作为自变量，进行二分类Logistic 回归分析，结果显示只有年龄是HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者漏诊HSIL 及以上病例的危险因素。见表4。

表4 HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者漏诊HSIL 及以上病例的危险因素分析

3 讨论

目前研究表明，当HR-HPV 一过性或早期感染时，病毒DNA 在细胞核内处于游离状态，E6/E7 mRNA 不表达或低表达；当HR-HPV 持续感染时，病毒DNA 与宿主基因整合，E6/E7 被激活，E6/E7 mRNA 高水平表达。因此，E6/E7 mRNA 表达水平的高低与病毒宿主基因整合及感染状态相关联，在HPV 的致病过程中起着关键的枢纽作用。HPV E6/E7 mRNA 在准确性和相关性方面比HPV DNA 和细胞学对病变的指示性更好，显示了宫颈癌新的筛查前景，有望成为宫颈癌初筛的首选［1］。

对于HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性患者下一步应该如何评估呢？细胞学、阴道镜检查都是临床常用的方法。本研究466 例HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性患者中，细胞学HSIL 只有4 例，占0.86%。而细胞学正常者达375 例，占80.47%，而且在细胞学正常的HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性患者中检出病理组织学为HSIL 病例29 例，检出率7.73%。可见，对于HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性患者单纯依靠细胞学分流可能会漏诊HSIL 以上病例。虽然阴道镜检查可以作为进一步评估是否存在宫颈病变的方法，但只有当阴道镜下转化区及病变区域完全可见，才能视为阴道镜检查充分，漏诊浸润癌的风险才可能降低。因此存在局限性［3］。SONG 等［4］研究发现，在阴道镜检查阴性的细胞学LSIL、HPV 阳性患者中，随机活检检出HSIL 及以上病例占12.5%。SØRBYE 等［5］研究发现，阴道镜活检阴性或低度病变的520 例女性在2005～2009 年随访期间有124 例（23.8%）发生CIN2+病变。刘丽等［6］研究发现，E6/E7 mRNA 表达阳性的女性，即使阴道镜检查结果为阴性，1 年后随访发现，E6/E7 mRNA 阳性者CINⅡ+（包括CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌）发生率为11.01%（12/109）。本研究在466 例阴道镜检查阴性的HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性患者中检出42 例组织学HSIL，检出率为9.01%（42/466）；腺癌1 例，检出率为0.21%（1/466）。因此，若以HPV E6/E7 mRNA 作为宫颈癌的初筛，对于阳性结果必须高度重视，即使细胞学、阴道镜评估均为阴性，仍有一定比率漏诊HSIL 甚至是宫颈癌。那么，有哪些是漏诊的危险因素呢？

在关于HR-HPV 亚型感染与子宫颈癌及其癌前病变关系的研究上，不少研究发现不同亚型HPV 的致病能力不同。2014 年4 月，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了HPV 分型检测可以作为子宫颈癌的初筛手段应用于临床工作中。马莉等［7］研究发现，高危型HPV 分型检测在子宫颈癌及其癌前病变的筛查中具有指导意义，HPV16、52 和58 型感染者发生≥CINⅡ病变的可能性大，HPV18 型虽不是主要HPV 感染亚型，但其与≥子宫颈腺上皮内瘤变（CGIN）Ⅱ病变密切相关。王家建等［8］的研究表明，基于HPV E6、E7 mRNA检测的方法的Aptima HPV 检测阳性特别是16 型和HPV 18 型和（或）45 型阳性的妇女发生组织学诊断≥HSIL 病变的可能性大。本研究中，HPV16型、18/45 型、其他型别中组织学HSIL 及以上病例中检出率分别为14.89%（14/94）、8.57%（6/70）、7.62%（23/302），虽然HPV16 型中的检出率最高，但三组在检出HSIL 及以上病例中的差异无统计学意义，Logistic 回归分析也未能显示HPV 型别是阴道镜检查阴性的HPV E6/E7 mRNA 阳性患者漏诊HSIL 及以上病例的危险因素。分析其原因，可能是E6/E7 mRNA 意味着HPV 病毒DNA 与宿主基因已经发生了整合，因此与型别关系不大有关系。但具体原因及是否是漏诊HSIL 的高危因素仍需要进一步深入研究。

在关于年龄的因素研究中，PRUSKI 等［9］研究表明，在50 岁以下的患者中，HR-HPV E6/E7 mRNA 检测敏感度和特异性随着年龄的增加而增加。聂小倩等［10］的研究表明，高年龄组HPV E6/E7 mRNA 阳性率高于低年龄组，差异有统计学意义。这提示在不同年龄段，高危型HPV E6/E7 mRNA检测可能有不同的临床诊断价值［11］。曹倩文等［3］对绝经后子宫颈高级别鳞状上皮内病变诊治方式的探讨发现，绝经组阴道镜下子宫颈活检漏诊子宫颈癌的比例高于未绝经组（分别为9.4% 和3.8%）。本研究中，在阴道镜检查阴性的所有年龄组中，均发现漏诊HSIL 及以上的病例。而且随着年龄的增加，组织学HSIL 及以上病例的检出率呈上升趋势，且差异有统计学意义（χ2=13.328,P=0.020）。Logistic 回归分析也显示年龄是HPV E6/E7 mRNA 阳性而阴道镜检查阴性的患者漏诊HSIL 及以上病例的危险因素［O^R：1.070,95%CI：1.027～1.114（P<0.05）］。分析其原因，可能是年龄越大的女性，尤其是绝经后女性，雌激素水平下降，宫颈上皮变薄，鳞柱交界向颈管内移，阴道镜下常常表现为Ⅲ型转化区，很难发现一些微小病灶，而出现漏诊。因此对于年龄越大的女性，尤其是绝经后女性，如果HPV E6/E7 mRNA 初筛阳性，即使阴道镜检查阴性，除了要参考TCT 结果外，也可以考虑进行常规活检，必要时行ECC，以免遗漏HSIL 及以上病例。

综上所述，对于HPV E6/E7 mRNA 阳性的女性，如果阴道镜检查阴性，需要参考TCT 结果并结合年龄因素的影响，必要时行宫颈活检和/或ECC，以免遗漏HSIL 及以上病例。