阿魏酸钠通过ERK信号通路干预大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究

张博伦，王丽，胡雅光，林富，卢德永

（锦州医科大学附属第三医院，辽宁 锦州 121000）

急性心肌梗死（AMI）是缺血性心脏疾病中导致人类死亡的重要因素。目前，心脏血管的再通技术仍是治疗AMI 的最有效和最直观方法，血管生成治疗是治疗缺血性心肌病的主要手段［1］，如心脏搭桥手术或经皮冠脉介入术（PCI）。心肌缺血治疗最重要的是侧支循环的建立［2］，然而心肌缺血再灌注损伤（MIRI）严重影响心脏病患者的治疗效果及预后心肌损伤的恶化。

阿魏酸钠（SF）可以通过ERK1/2 信号途径上调血管内皮生长因子（VEGF）蛋白，进而促进血管新生，增加缺血、缺氧心肌的侧枝循环，提高心肌细胞存活率，降低AMI 患者的病死率。目前通过应用VEGF 蛋白、VEGF 基因上调VEGF 治疗心肌缺血存在局限性，因此根据VEGF 促进血管生成的作用机制，寻找从多靶点、多环节干预VEGF 生成的药物具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD 大鼠40 只，200～230g。将大鼠适应性饲养1 周后，随机分为假手术组（Sham组）、模型组（MI/R 组）、阿魏酸钠组（SF 组）、SF+ERK1/2 抑制剂组（In 组），每组10 只。Sham组、MI/R 组均每日1 次腹腔注射2 mL 生理盐水，SF 组每日1 次腹腔注射SF（40mg/kg）用生理盐水稀释成2 mL 的液体，In 组每日1 次腹腔注射SF（40 mg/kg）+U0126（10 μmol/L）用生理盐水稀释成2 mL 液体。2 周后造模：术前禁食12 h、称重，10%水合氯醛腹腔麻醉，气管插管，四肢皮下组织插入针形电极，接心电监护仪、心电图机，记录标准Ⅱ导联的心电图。胸部去毛、消毒，沿胸骨左侧旁行切口，剪断第3～4 根肋骨，轻压右胸腔，充分暴露心脏；在肺动脉圆锥与左心耳间分离出左冠状动脉前降支，除Sham 组只开胸不结扎外，其余各组在左前降支发出1～2 mm 处结扎，结扎30 min 后、再灌注120min，即为缺血-再灌注损伤模型。以心电图改变作为缺血再灌注造模成功的标志：结扎左前降支后见心电图Ⅱ导联ST 段抬高，增宽；再灌注时抬高的ST 段回落>50%［3］。造模后每只大鼠腹腔注射青霉素8 万U抗感染，连续应用3 d，分别于12 h 后尾静脉取血，1 周后处死大鼠，取心脏组织。

1.2 观察指标

1.2.1 血浆心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）浓度 大鼠尾静脉取血于（加抗凝剂）试管中，离心（3 000 r/min）提取血浆，于-4℃冰箱中暂时保存。全自动生化分析仪上检测血浆cTnⅠ，估测心肌损伤程度；血浆NT-proBNP 估测心功能。

1.2.2 免疫组织化学法检测心肌中VEGF 及微血管密度（MVD）的表达 取10%甲醛固定梗死周边缺血区心肌组织，并进行常规石蜡包埋及作心肌切片（5 μm），在400 倍视野下分别检测VEGF蛋白质、MVD 的表达，MVD 用CD31 阳性表达结果表示：细胞胞浆颜色呈棕黄色染色为阳性，随后测定平均光密度值并作半定量分析。

1.2.3 Western blotting 方法检测心肌p-ERK1/2 信号蛋白 通过心肌蛋白的提取、转模及杂交、反复洗膜后，将膜与适当比例稀释后的一抗（t-ERK1/2、p-ERK1/2 兔抗均1∶500）4℃孵育过夜，再次反复洗模后，把模放入装有二抗的离心管中，室温轻摇1.5 h、洗膜，用Western blotting 显迹；同时用抗体ERK1/2（1∶500）作为内参照，分别用不加ERK1/2 抗体作为阴性对照。

1.2.4 心肌梗死面积的测定 实验结束后，每组随机取4 只心脏，冲洗残余血液后，沿冠状沟剪去心房及各大血管，留取心室组织、称重；然后平行于冠状沟将心室肌切成4～5 片、厚约1 mm，置于0.05%浓度的NBT 溶液中，37℃恒温水浴振摇染色15 min，直至正常心肌染为深紫色。梗死区心肌区域未着色为淡红色取出，冲洗组织后、微距拍照，3 倍放大洗像。采用BI2000 图象分析系统计算左心室面积、梗死区面积，梗死范围表示为梗死区心肌面积占全心室面积的百分比。

1.2.5 心肌组织病理学改变 实验结束后取出心脏，立即将50 mL 固定液注入离体心脏主动脉内，5 min 后将左心室前壁心肌组织中间层切成条状，放在上述固定液中2 h；然后在0.09 mol KH2P04（7.5%蔗糖，pH 值7.4）中漂洗15 min，并在此溶液中保存。依次常规酒精逐级脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋，间断均匀切片，切片均为5mm 厚做苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察心肌细胞组织学结构改变。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA）、SNK 检验，病理形态学资料用对比描述分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组血浆cTnⅠ、NT-proBNP 水平比较

与Sham 组比较，其余各组血浆cTn Ⅰ、NT-proBNP 水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），说明各组大鼠心肌细胞发生了不同程度的损伤，其中MI/R 组损伤最严重。与MI/R 组比较，SF 组cTnⅠ、NT-proBNP 浓度降低，差异有统计学意义（P<0.05），说明给予SF 预处理后，大鼠心肌细胞损伤程度降低。与SF 组比较，加入ERK1/2 抑制剂U0126 后，cTnⅠ、NT-proBNP 浓度升高，差异有统计学意义（P<0.05），表明ERK1/2 信号通路抑制剂抑制SF 对心肌组织的保护作用。见表1。

表1 4 组血浆cTnⅠ、NT-proBNP 水平比较（n=10,）

表1 4 组血浆cTnⅠ、NT-proBNP 水平比较（n=10,）

2.2 4 组心肌组织VEGF 蛋白及MVD 的变化比较

与Sham 组比较，MI/R 组心肌组织中VEGF蛋白增加，差异有统计学意义（P<0.05），提示在缺血、缺氧状态下VEGF 蛋白反应性增加。与MI/R组比较，SF 组心肌组织VEGF 蛋白增加，差异有统计学意义（P<0.05），提示SF 可以增加VEGF蛋白的生成；加入U0126 抑制剂后，In 组心肌组织VEGF 蛋白下降，差异有统计学意义（P<0.05），表明SF 促进VEGF 的生成与ERK1/2 信号通路密切相关。见图1、2。

图1 免疫组织化学方法所示，4 组VEGF 蛋白阳性表达结果（×400）

2.3 4 组CD31 阳性表达结果比较

图2 4 组VEGF 蛋白阳性表达结果（n=10,）

与Sham 组比较，其余各组心肌组织CD31 阳性表达减少，差异有统计学意义（P<0.05），提示因缺血、缺氧导致心肌组织微血管密度降低。与MI/R 组比较，SF 组心肌组织CD31 阳性表达增加，差异有统计学意义（P<0.05），提示SF 可以增加微血管密度的生成；加入U0126 抑制剂后，In 组心肌组织CD31 阳性表达下降，差异有统计学意义（P<0.05），表明SF 促进微血管生成的作用与ERK1/2 信号通路密切相关。见图3、4。

图3 免疫组织化学方法所示，4 组CD31 阳性表达结果（×400）

图4 4 组CD31 阳性表达结果（n=10,）

2.4 4 组心肌组织p-ERK1/2 信号蛋白变化比较

实验结果显示，与Sham 组比较，其余各实验组心肌组织p-ERK1/2 信号通道蛋白增加，差异有统计学意义（P<0.05），这与VEGF 蛋白增加呈明显的相关趋势。与MI/R 组比较，SF 组的心肌组织p-ERK1/2 信号通道蛋白增加，差异有统计学意义（P<0.05）。加入U0126 抑制剂后p-ERK1/2 信号通道蛋白减少，差异有统计学意义（P<0.05），这表明通过U0126 抑制剂的作用，In 组p-ERK1/2 信号通道蛋白表达被抑制。通过上述实验表明，心肌组织VEGF 蛋白、p-ERK1/2 信号蛋白表达呈正相关性（P<0.05）。见图5、6。

图5 4 组p-ERK1/2 信号蛋白的表达（n=10,）

图6 4 组心肌组织p-ERK1/2 信号通道蛋白、t-ERK1/2蛋白表达

2.5 4 组大鼠心肌梗死面积比较

与Sham 组比较，其余各组心肌组织梗死面积增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与MI/R 组比较，SF 组心肌梗死面积减少，差异有统计学意义（P<0.05）；加入U0126 抑制剂后心肌组织梗死面积增加，差异有统计学意义（P<0.05）。SF 通过ERK1/2 信号通路减少MIRI，减少心肌细胞凋亡，预防心肌组织坏死，SF 对心肌组织的保护作用与ERK1/2 信号通道蛋白密切相关。见表2。

表2 4 组大鼠心肌梗死面积比较（n=10,,%）

表2 4 组大鼠心肌梗死面积比较（n=10,,%）

2.6 4 组心肌组织病理学改变

光学显微镜下形态学变化：Sham 组中心肌纤维、细胞核均匀排列，间质中无炎细胞浸润；MI/R组和In 组中可见大量心肌纤维断裂和间质中炎细胞浸润，并见大量的核固缩、核碎裂；SF 组中心肌纤维断裂减少，间质中少量炎细胞浸润，清晰浓染的细胞核。见图7。

图7 4 组心肌组织病理形态学观察（×400）

3 讨论

AMI 的治疗从最初的药物治疗发展到溶栓、经皮腔内冠状动脉成形术、支架植入术、冠状动脉旁路术、激光再通、心肌打孔等恢复血流再通，但是心肌缺血再灌注后出现的心律失常、无复流、心肌凋亡、坏死等情况反而加重了心肌损伤［4］。在缺血再灌注中，心肌梗死面积是影响心功能的主要原因，因此通过减少心肌梗死面积，增加心肌组织的血流供应是解决缺血再灌注损伤的有效途径之一［5］。

血管生成被认为是心肌组织缺血、缺氧后的一种适应性反应，同时其在治疗缺血性疾病中被认为是一个靶向目标，其中就包括通过改善微循环治疗心肌缺血［6-7］。VEGF 是血管生成因素之一，参与了血管生成的所有阶段，包括血管的生成发芽、不成熟的新生血管新芽的稳定、成熟的生理血管生成［6］。VEGF 通过诱导血管生成恢复心肌的血液供应，保护左心室功能和预防左心室重构，降低死亡率［8］。多项研究表明，PI3K/Akt 信号通路和MAPK/ERK 信号通路可以通过介导转录因子HIF-1a 诱导VEGF 表达［9-10］，其中ERK1/2 途径涉及多种细胞功能，包括细胞存活、细胞凋亡和增殖。

SF 是桂皮酸的衍生物之一，活血化淤是其主要功能，可有效抑制血管内皮素的分泌，促进一氧化氮的生成，具有抗血小板活性、抑制血小板5-羟色胺释放、抗氧化、清除自由基和调节血管舒缩、保护血管内皮功能等多种药理作用。SF 可以有效降低冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的血脂水平，其促进血液流动，增加冠状动脉血流量，缓解血管平滑肌痉挛，改善心肌供血和预防心肌梗死的发生，应当成为临床预防和治疗该病的重要用药选择。然而国内外对其在MIRI 中对VEGF的影响方面的研究报道较少，本课题采用SF 预处理SD 大鼠模型，检测大鼠心肌组织MIRI 指标，观察SF 对大鼠急性心肌缺血再灌注后心肌组织、VEGF 蛋白、微血管密度及ERK1/2 信号通路相关蛋白表达的影响，探讨其对MIRI 的保护作用及可能机制，为防治MIRI 提供新思路。

本研究结果发现，SF 组与In 组比较，cTnⅠ、NT-proBNP 水平降低，比较有差异；与MI/R 组比较降低更加显著，比较亦有差异，说明应用SF 预处理后MIRI 程度减轻，保护和改善了左室心肌功能，减少了心肌梗死面积。与Sham 组比较，MI/R组VEGF 蛋白表达增加，表明心肌组织在缺血、缺氧状态下VEGF 适应性增加，而CD31 阳性表达的下降又表明VEGF 的水平并不能有效促进微血管生成，达到减少MIRI 目的。与MI/R 组比较，SF 组VEGF 蛋白和CD31 阳性表达均有显著增高，说明SF 预处理可明显上调VEGF 蛋白的表达水平，并起到了促进微血管的生成、降低MIRI 的程度，具有改善心功能的作用。与SF 组比较，加入ERK1/2 特异性抑制剂U0126 后，p-ERK1/2 信号蛋白表达下降，同时伴随着VEGF 蛋白与CD31 阳性表达的降低，这进一步说明ERK1/2 信号通路参与了VEGF 促进微血管生成的过程。

本研究结果表明：①SF 在MI/RI 时，通过上调VEGF 介导I/R 过程中的心脏保护作用；②SF对I/R 心肌的保护机制与增加微血管生成、改善微循环有关；③SF 在I/RI 时的心脏保护作用机制，可能与ERK1/2 信号通路有关。

AMI 后的心肌组织血液供应急剧下降，坏死心肌组织参与心室重构并加重心力衰竭，通过增加微循环改善缺血心肌的血液供应，预防性的避免心肌组织损伤的进一步加重，是目前治疗心肌缺血最有效和最直观的途径。缺血心肌通过VEGF增加血管生成、改善微循环，进而改善心脏射血功能是目前临床治疗重要的突破口。应用VEGF蛋白、VEGF 基因增加血管生成，改善心肌缺血侧枝循环功能是可行的，但是须有临床大样本及更长时期的研究观察。在当前治疗心血管疾病的药物中发现更多有利于改善心肌功能、增加新生血管形成的药物，以便为临床药物的应用提供更有力的证据。

综上所述，VEGF 通过增加微血管生成、改善心肌组织血供、降低MIRI。SF 可以通过ERK1/2信号通路上调VEGF 蛋白，进而增加微血管生成，起到保护大鼠MIRI 的作用。