5-Aza-cdR可能通过提高海马组织内NR2B磷酸化水平改善小鼠学习和记忆能力

刘晓蕾，王 强，张晓璐，邵 国*，姜树原,3*

(包头医学院1.内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室；2.基础医学与法医学院；3.药学院，内蒙古 包头 014040)

N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)在中枢神经系统中的兴奋突触传递、突触可塑性和兴奋性毒性中起关键作用。NR是由2个NR1亚基和2个NR2亚基构成的异聚体。NR2A以及NR2B亚基，主要在成人大脑皮层和海马中表达[1-2]。前脑中过表达NR2B的小鼠，其在各种学习记忆行为中表现出卓越的学习和记忆能力[3]。然而，通过反义RNA敲低NR2B表达，可消除NMDA依赖性的长时程增强(long-term potentia-tion，LTP)，造成空间学习记忆能力损伤。

突触可塑性和行为与p-Y1472 NR2B密不可分。研究发现，在大鼠岛叶皮层突触后致密物(postsynaptic density，PSD)中，p-Y1472 NR2B水平升高，对大鼠的学习能力有一定的影响。5-Aza-CdR可提高小鼠的空间学习记忆能力，降低PP-1γ活性[4]。抑制PP-1活性可降低CDK5的活性[5]。抑制CDK5的活性可使突触中Src激酶活性和p-Y1472 NR2B水平升高[6]。因此，推断5-Aza-CdR可能通过PP-1/CDK5通路改变p-Y1472 NR2B水平影响学习记忆功能。

在表观遗传学研究中，由于DNA甲基化对正常细胞有重要的影响，所以去甲基化试剂5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对细胞周期、分化、死亡及改变动物行为也有着举足轻重的作用[4,7]。前期研究发现，5-Aza-CdR能使小鼠在水迷宫中的行为有所改变，同时NR2B及其位点的磷酸化在小鼠行为中也扮演着重要角色，因此，本文旨在探讨5-Aza-CdR对小鼠海马NR2B及其磷酸化的影响，以及其在跳台实验中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级6～8周龄ICR雄性小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXK (京)2016-0002])，体质量18～22 g,60只。本研究经包头医学院实验动物伦理委员会批准[包医伦审 2018第(012)号]。在实验过程中，严格按实验动物使用的3R原则给与人道的关怀。

1.1.2 主要试剂：5-Aza-CdR(Sigma-Aldrich 公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；反转录试剂盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix(TaKaRa公司)；RIPA细胞裂解液、ECL发光液(上海碧云天生物技术有限公司)；蛋白酶抑制剂HaltTMProtease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail (×100)(Thermo Fisher公司)；BCA蛋白检测试剂盒(美国Pierce公司)；兔抗NR2B抗体、兔抗NR2B多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；兔抗p-Y1472 NR2B抗体(Phosphosolutions公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的驴抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)；ADP-GloTM+ CDK5/p35 Kinase Enzyme System试剂盒(Promega公司)；Texas Red标记的山羊抗兔二抗(Jackson Laboratory公司)；含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的封片剂(Vector公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将小鼠随机分为对照组(control)和5-Aza-CdR处理组(5-Aza-CdR)，右侧脑室内注射5 μL 10 μmol/L的5-Aza-CdR。使用显微注射泵以1 μL/min的速率注射5 min，留针1 min以防止回流。缓慢退针，缝合伤口。侧脑室注射方法见参考文献[5]。

1.2.2 跳台实验检测：跳台实验是海马依赖性认知实验，可以评估短期记忆和长期记忆[8]，实验动物为避免电击而选择跳台。通过记录小鼠被动逃避延迟时间，以及出现差错的次数来完成[9]。这个实验分为两个部分：训练和测验。跳台实验使用的仪器是SDT-8系统。训练和测验方法见参考文献[9]。

1.2.3 Real-time PCR检测小鼠海马组织NR2B mRNA：每组取6只小鼠，均断头取脑，剥离海马组织，Trizol法提取小鼠海马组织RNA并测定其浓度和纯度。取1 μg RNA反转录为cDNA并扩增,NR2B 上游引物：5′-AACGTTCACGTAGCTCCAG-3′，下游引物：5′-CTCGTCCGATATGGCTCCTTCA-3′；β-actin上游引物：5′-AGCTGATGGTCTGAGACA-3′，下游引物：5′-GCTCATCGATCGCATCAA-3′。使用20 μL反应体系。反应程序：50 ℃×2 min,95 ℃×3 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,73 ℃ 30 s，40个循环，72 ℃ 2 min。根据数据结果，利用2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。

1.2.4 Western blot 检测小鼠海马组织中NR2B和p-Y1472 NR2B蛋白：每组取6只小鼠，均断头取脑，剥离海马组织，加入RIPA裂解液(1 mL/mg)裂解小鼠海马组织，同时加入蛋白酶抑制剂，冰上超声裂解，提取海马组织中的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，进行 SDS-PAGE时，蛋白上样量为20 μg，后转移至PVDF膜，室温用5%的脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗(1∶500)，4 ℃过夜，1×TBST洗膜3次，每次8 min，加入HRP标记的驴抗兔二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，1×TBST洗3次，每次8 min，ECL化学发光，检测。

1.2.5 CDK5激酶活性检测：冰上用玻璃匀浆器将海马组织制备成匀浆，离心取上清，使用ADP-GloTM+CDK5/p35 Kinase Enzyme System试剂盒检测其CDK5活性。

1.2.6 免疫荧光检测NR2B和p-Y1472 NR2B的表达：用0.01 mol/L的PBS冲洗脑组织，然后用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液进行灌注固定，取其脑组织置于4%多聚甲醛，4 ℃下固定 6～8 h，PBS清洗2次。然后，放于30%蔗糖溶液中脱水72 h，OCT进行包埋。使用低温冷冻恒温切片机切冠状切片(厚度20 μm)。切片经0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min。用10%山羊血清室温封闭1 h。加入兔抗NR2B多克隆抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜。用PBS清洗3次，每次10 min，加入Texas Red标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温避光孵育4 h。PBS清洗3次，每次10 min。用含有DAPI的封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对跳台实验小鼠学习记忆能力的影响

5-Aza-CdR组较对照组跳台潜伏期增加，错误次数减少(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control group图1 5-Aza-CdR对跳台实验小鼠的影响Fig 1 Effects of 5-Aza-CdR on the step-down test

2.2 5-Aza-CdR对小鼠海马组织中NR2B和p-Y1472 NR2B表达的影响

5-Aza-CdR组小鼠海马组织中NR2B的mRNA水平为5.98×10-5±0.27(n=6)与对照组5.62×10-5±0.28 (n=6)相近。5-Aza-CdR组p-Y1472 NR2B的表达水平显著增强(P<0.05)，NR2B蛋白表达水平与mRNA都没有明显变化(图2)。

A.Western blot;B.semi-quantitative analysis of protein expression;*P<0.05 compared with the control group图2 5-Aza-CdR对小鼠海马组织中NR2B和p-Y1472 NR2B表达的影响Fig 2 Effects of 5-Aza-CdR on the expression of NR2B,and p-Y1472

2.3 5-Aza-CdR对小鼠海马CA1、CA3区NR2B和p-Y1472 NR2B表达的影响

对照组和5-Aza-CdR组海马CA1和CA3区NR2B的荧光强度没有差异。然而，在5-Aza-CdR组的CA1区p-Y1472 NR2B表达明显高于对照组CA1(P<0.05)(图3)。

A.NR2B in the control group(A1:CA1;A2:CA3);B.NR2B in the 5-Aza group(B1:CA1;B2:CA3);C.NR2B fluorescence intensity;D.p-Y1472 NR2B in the control group(D1:CA1;D2:CA3);E.p-Y1472 NR2B in the 5-Aza group(E1:CA1;E2:CA3);F.p-Y1472 fluorescence intensity;*P<0.05 compared with CA1 and CA3图3 5-Aza-CdR对小鼠海马CA1、CA3区NR2B和p-Y1472 NR2B表达的影响Fig 3 Confocal analysis the immunofluorescence staining of NR2B and p-Y1472 NR2B in the CA1 and CA3 region of the hippocampus in mice that were treated with 5-Aza or

2.4 5-Aza-CdR对小鼠海马组织中CDK5活性的影响

5-Aza-CdR组中CDK5的活性为0.22±0.04显著低于对照组的0.27±0.05(P<0.05)。

3 讨论

DNA甲基化参与了学习和记忆能力的形成[10]，研究发现，侧脑室注射5-Aza-CdR可以改善小鼠空间学习和记忆能力(水迷宫实验)，并降低PP-1γ的表达[4]，PP-1在5-Aza-CdR诱导学习和记忆的改变中起到了至关重要的作用。

PP1通过突触信号在学习和记忆中发挥重要作用，但PP1如何调节突触可塑性仍然未知[11]。PP1抑制剂可以改变小鼠在跳台实验中的行为。本研究发现5-Aza-CdR可以提高小鼠在跳台实验中的学习和记忆能力，这种能力的改变可能是通过PP-1γ的表达降低来调控的。CDK5是一种脯氨酸介导的丝/苏氨酸激酶，在中枢神经系统中具有很高的活性，PP1可以调节CDK5的活性[5]。CDK5已被证明通过调节谷氨酸受体的降解来影响学习和记忆及突触可塑性。成人大脑中CDK5的缺失提高了海马的行为学习和记忆能力，并增强了突触可塑性[12]。本研究中推测5-Aza-CdR通过PP-1γ表达降低而使CDK5活性降低，进而提高了跳台实验中动物学习和记忆能力。

研究表明CDK5活性的降低导致p-Y1472 NR2B水平的增加。抑制CDK5增加了Src激酶与PSD-95的结合以及Src激酶对p-Y1472 NR2B的磷酸化作用。NR2B和p-Y1472 NR2B在学习和记忆功能中起着关键的作用[13]。本实验结果显示，5-Aza-CdR可以影响CA1区NR2B的磷酸化水平，并不会影响NR2B的表达。众所周知，DNA甲基化在调节长时程可塑性和记忆中具有重要作用[14]。5-Aza-CdR可通过甲基化和非甲基化调控基因的表达[15-16]。因此，5-Aza-CdR对细胞或组织的影响是一个复杂的机制。

总之，5-Aza-CdR可影响小鼠在跳台中的行为学，而海马CA1区p-Y1472 NR2B的水平变化影响着行为学的变化。因此5-Aza-CdR如何影响脑中p-Y1472 NR2B变化的分子机制还需进一步深入研究。