血清miR-181b和miR-27a表达与颈动脉粥样硬化程度相关

张传西，张 宇，郭莎莎，厉 菁，袁义强，王明杰

(郑州市第七人民医院 心内科，河南 郑州 450000)

血脂异常是指体内脂蛋白代谢异常，与动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)关系密切，且是冠心病和缺血性脑卒中的独立危险因素。颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis，CAS)是全身动脉粥样硬化在颈动脉的表现，以颈动脉内膜灶性纤维增厚及粥样斑块形成为主要病理表现，可导致颈动脉管腔狭窄、变硬[1]。颈动脉是颅脑重要供血通道，CAS发生后可增加脑梗死风险，对社会及医疗机构造成极大的负担[2]。因此，了解血脂异常患者发生CAS的危险因素，以及时采取针对性的措施，对防止CAS的发生与进展具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的单链成熟内源性非编码小分子RNA，可调控细胞多种生物学功能，参与脂质代谢、血管生成、自身免疫及炎性反应等活动，成为各类疾病发生发展机制的研究热点[3]。AS的发生受多种miRNA的调控，如miR-188b、miR-27a能够影响细胞内胆固醇的流出，参与AS的发展[4-5]。目前关于miRNA与AS发生机制的相关研究较多，但关于其在血清中的表达情况及对CAS预测作用研究较少。故本研究通过调查血脂异常患者血清中miR-181b、miR-27a的表达情况分析与CAS病变程度的关系。

1 资料与方法

1.1 资料

选取2018年3月至2019年12月体检的血脂异常患者102例，均符合《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》[6]对血脂异常的诊断，入院前服用影响血脂代谢相关药物，其中男56名，女46名，年龄28～82岁，平均(43.6±12.8)岁。另选取健康人100例为对照组，其中男52名，女48名，年龄25～80岁，平均(42.9±12.5)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义，具有可比性。研究在实施前已经医院伦理委员会批准(伦理审批号：2017021)，纳入研究者对本次研究内容均知情同意，并签署同意书。

RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；Prime ScriPtTM反转录试剂盒(TaqMan公司)；实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quanti-tative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测试剂盒(ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测血清miR-181b、miR-27a相对表达量：抽取受试着空腹肘静脉血4 mL，抗凝试管中室温静置2 h，3 500 r/min离心10 min，离心半径10 cm，分离上层血清，保存于-20 ℃待检。以实时荧光定量PCR检测miR-181b、miR-27a mRNA相对表达量，提取总RNA，反转录获得cDNA，根据试剂盒说明书设定反应体系及反应条件，以U6为内参，2-△△Ct为目的基因相对表达强度。

1.2.2 CAS的诊断、严重程度的判断及分组：使用LOGIO E9彩色多普勒超声仪，探头频率5～10 MHz，从颈动脉近心端向远心端检测双侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉、颈动脉分叉处，观察有无斑块、内部回声，记录斑块形态、大小、内膜回声并检测颈动脉内膜-中层厚度(intima-media thickness，IMT)。以IMT≥1.2 mm，超声检查局部有粥样硬化斑块或团块回声增强且附着于管壁、管壁不均匀增厚则诊断为CAS[7]。以Crouse积分评估CAS的严重程度，Crouse积分不考虑斑块长度，以双侧颈动脉各个孤立性粥样硬化斑块的最大厚度相加为Crouse积分，分数越高则CAS病变程度越严重[8]。将符合CAS诊断标准者纳入硬化组，否则纳入未硬化组。

1.2.3 收集可能的影响因素：统计硬化组和未硬化组的相关资料，包括性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、高血压、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density cipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(hight density cipoprotein-cholesterol，HDL-C)、血尿酸(uric acid，UA)、超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、高胆固醇血症、缺血性事件史(冠心病、缺血性脑血管疾病、外周动脉疾病等)、糖尿病。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清miR-181b、miR-27a相对表达量比较

血脂异常患者血清miR-181b相对表达量低于对照组，而miR-27a相对表达量高于对照组(P<0.05)。两组中男性与女性以及年龄≥60岁和<60岁miR-181b、miR-27a相对表达量无差异(表1)。

表1 miR-181b、miR-27a mRNA相对表达量比较Table 1 Comparison of relative miRNA expression of

2.2 硬化组与未硬化组发生CAS可能因素差异比较

血脂异常患者中59例发生CAS，CAS发生率为57.84%。硬化组外周血清miR-181b mRNA相对表达量低于未硬化组，外周血清miR-27a mRNA相对表达量、hs-CRP、LDL-C水平高于未硬化组，高血压占比大于未硬化组(P<0.05)；两组年龄、FBG、BMI、TG、TC、HDL-C、UA水平及性别、吸烟、饮酒、高胆固醇血症、缺血性事件史、糖尿病构成比比较无差异(表2)。

表2 硬化组与未硬化组发生CAS可能因素差异比较Table 2 Comparison of possible factors of CAS between cirrhosis group and non cirrhosis group

2.3 Logistic多因素回归分析CAS发生的影响因素

将可能影响血脂异常患者发生CAS的影响因素作为自变量(X)，以是否发生CAS为因变量(Y)，进行相关因素赋值，发生CAS记为1，未发生记为0，赋值结果见表3。Logistic回归分析显示，外周血清miR-181b、miR-27a水平、hs-CRP、LDL-C、高血压均是影响血脂异常患者发生CAS的独立影响因素(P<0.05)(表4)。

表3 Logistic多因素回归分析赋值Table 3 Assignment of Logistic multiple regression analysis

表4 Logistic多因素回归分析发生CAS的独立影响因素Table 4 Independent influencing factors of CAS in Logistic multiple factor regression analysis

2.4 外周血清miR-181b、miR-27a相对表达量对血脂异常患者发生CAS的预测价值分析

以miR-181b相对表达量<18.33、miR-27a相对表达量>1.54为阳性，二者均为阳性为联合检测标准，经Kappa一致性检验，血清miR-181b联合miR-27a预测CAS的效能较高(Kappa=0.801，P<0.05)(表5)。

2.5 外周血清miR-181b、miR-27a相对表达量与Crouse积分的相关性分析

硬化组的Crouse积分为(9.35±1.20)分，血清miR-181b相对表达量与Crouse积分呈负相关(P<0.05)，外周血清miR-27a 相对表达量与Crouse积分呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

生化检测技术作为诊断、预测疾病的方式，具有操作简单、创伤小、可重复性强的优势，是CAS辅助诊断的首选。随着基因学技术的不断发展，miRNA受到关注，作为参与机体生长、发育、疾病发生的调控基因，miRNA参与AS的发生、发展及斑块破裂的全过程[9]。本研究通过探讨血脂异常患者中外周血清miR-181b、miR-27a的表达差异及其与CAS的关系，以期寻找可早期预测CAS的生物学标志物。

miR-181b能够调控血管炎性反应，其表达水平下降能下调p70S6K表达增加巨噬细胞活性，抑制CAS斑块的形成，因此miR-181b的表达水平与CAS的发生密切相关[10]。miR-27a属于基因间miRNA，参与调控糖脂代谢、脂肪细胞分化、血管生成、炎性因子的表达等影响CAS发生的相关因素[11]。miR-27a可靶向沉默ABCA1的表达及其介导的胆固醇流出，增加细胞内脂质蓄积[12]。本研究中血脂异常患者中外周血清miR-181b相对表达量下降，miR-27a相对表达量升高，说明外周血清miR-181b、miR-27a的异常表达与血脂异常的发生有关，推断可通过检测外周血清miR-181b、miR-27a的表达监测CAS的发生。

本研究还显示，硬化组外周血清miR-181b、miR-27a、hs-CRP、LDL-C水平及高血压占比与未硬化组存在差异，Logistic回归分析均是发生CAS的独立影响因素，说明除hs-CRP、LDL-C、高血压等常规影响因素外，miR-181b、miR-27a亦是CAS发生的影响因素。CAS属于血管慢性炎性疾病，miR-181b可通过影响血管内皮炎性反应参与CAS的发生，其表达水平下降可诱导内皮细胞炎性反应和氧化应激反应，促进动脉粥样硬化的形成[13]。miR-27是具有脂代谢调节作用相关基因，可影响过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其下游脂肪酸代谢相关靶基因和靶蛋白的表达，影响体脂代谢[14]。此外本研究中ROC显示外周血清miR-181b、miR-27a预测血脂异常患者发生CAS具有一定的临床价值，二者联合的一致性较好，且血清miR-181b、miR-27a表达水平与Crouse积分均有明显的相关性，证实血清miR-181b、miR-27a表达水平可作为预测CAS的生物学标志物。

综上所述，血清miR-181b、miR-27a在血脂异常患者中表达异常且是导致CAS的独立影响因素，其中miR-181b的表达与CAS病变程度呈负相关，miR-27a则呈正相关。今后可考虑通过监测外周血清miR-181b、miR-27a表达量作为预测CAS的发生风险及病情严重程度判定的生化指标，以指导临床治疗。