液相微萃取法快速检测果蔬中噻菌灵残留量

杨续金，王东清，任俌政，李立敏，杨杨

1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院（呼和浩特 010018）；2.呼和浩特市绿林源农业科技开发有限公司（呼和浩特 010020）

噻菌灵（TBZ）是一种高效、广谱，广泛用于水果、蔬菜防治真菌性病害的苯并咪唑类（BMZs）杀菌剂[1-3]。TBZ既可用于多种作物的真菌病害防治，也可用于果蔬的防腐保鲜，还可用于工业防霉剂及人、畜肠道的驱虫药剂，在农药、医药及工业领域有重要应用[4-7]。TBZ经常被用作水果和蔬菜采摘后入冷藏前喷洒，防止长时间存放和运输而导致的霉变，以提供反季节的配送[8]。TBZ在自然状态下降解缓慢，具有较低的急性皮肤毒性，若在生产中过度使用，容易引起残留量超标，长期食入可能会引发免疫系统紊乱[9-10]，严重威胁消费者健康。因此，世界各国都制定了TBZ的残留限量标准，如GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[11]规定香蕉、柑橘类水果中TBZ的最大残留限量为10 mg/kg。欧盟（EU）和食品法典委员会（CAC）根据作物类型规定水果、蔬菜中TBZ的最大残留0.05～15 mg/kg限量[12-13]。

TBZ在果蔬中含量低，需要一种合适的提取方法才能准确可靠地分析其残留量。液-液萃取（LLE）、浊点萃取（CPE）[3,14-17]是经典的提取方法，此外还有加压液体萃取（PLE）法、盐析辅助均相液液萃取（SALLE）法、液相微萃取（LPME）法、固相微萃取（SPME）[3,18-21]等。LLE和CPE经典的提取方法，仅限于与水互相不溶的有机溶剂作为萃取剂，只适合简单基质中低极性有机物的萃取，且存在有机溶剂用量大、操作步骤多、成本高等缺点；PLE法需要在高温和高压的条件下进行，对提取设备的要求高；LPME是在液液萃取的基础上发展的新型微量化溶剂提取过程，减少供体相中的杂质对受体相的干扰，可以容纳更大体积的受体相，具有操作简单、快速、成本低、灵敏度高、稳定性好、环境污染小等优点。TBZ提取后，检测的方法有液相色谱-串联质谱仪测定分析、气相色谱-质谱仪测定分析、高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法、注射荧光检测法[5,10,17,22-24]等。这些技术大多需要昂贵的设备，操作步骤多，需要精细的处理等，高效液相色谱法还对某些化合物的灵敏度较低，它们是共洗脱和不可逆吸附的峰尾，有些不能被检测出来。试验采用紫外-可见分光光度计作为检测技术，结合LPME提取，检测TBZ残留量仅需20 min左右，既省时又经济，可更简便、快速、灵敏、准确、可靠地分析果蔬基质中TBZ残留量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄瓜、圣女果、香蕉、橘子（呼和浩特市绿林源农业科技开发有限公司）。

猪白细胞介素（Porcine interleukin，IL，GR级，Sigma公司）；Cu(NO3)2·3H2O（GR）、HNO3（GR）、乙腈（色谱级）、超纯水（色谱级）（北京百灵威科技有限公司）；N-丙基乙二胺（色谱级，东莞康润实验科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（GR，武汉华翔科洁生物技术有限公司）；邻苯二甲酸氢钾（GR）、氢氧化钠（AR）、无水硫酸镁（AR）、氯化钠（AR）、甲醇（AR）、磷酸二氢钠（AR）、柠檬酸（AR）、4.5 μm滤膜（北京康普汇维科技有限公司）；噻菌灵（纯度≥99%，武汉东康源科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

破壁机（HX-PB965，佛山市海迅电器有限公司）；旋涡混合器（XH-C，常州金坛良友仪器有限）；pH计（ST3100，奥豪斯仪器（常州）有限公司）；离心机（AnkeTGL-16B，上海安亭科学仪器厂）；紫外可见分光光度计（Shimadzu UV-1800 PC，日本）。

1.3 方法

1.3.1 样品处理与制备

对蔬菜、水果先用蒸馏水初步清洗，再用超纯水精细清洗后，用破壁机冷打状态下将样品打碎，称取15 g样品于50 mL带盖的离心管中，加入15 mL乙腈、3 g NaCl和12 g无水MgSO4用振荡器高速振荡2 min，在室温、4500 r/min下离心5 min。用移液管分别取3份5 mL上清液加到20 mL离心管中，分别加入0.2 gN-丙基乙二胺和0.6 g无水MgSO4用振荡器高速振荡2 min，在室温、4500 r/min下离心5 min后，用4.5 μm滤膜过滤得到TBZ提取液备用。

1.3.2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制

表1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制表[25]

1.3.3 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）缓冲液的配制

在100 mL容量瓶中加入32 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液后，加入1.021 g邻苯二甲酸氢钾用超纯水定容，配成pH 5.5的PVP缓冲液备用。加入1.5 mg PVP后配成15 mg/L pH 5.5的PVP缓冲液备用。PVP具有优异的溶解性和生物相容性[26]，理论上可以提高TBZ检出的灵敏度，为考察其这一性能，探究在TBZ提取液一组添加PVP和另一组不添加的2组对照设计。

1.3.4 标准溶液的配制

用乙腈溶解TBZ配制成200 mg/L的溶液，用乙腈逐步稀释制成不同浓度梯度的TBZ标准溶液。

用超纯水溶解Cu(NO3)2·3H2O配制成200 mg/L的溶液，用0.2 mol/L的HNO3溶液稀释制成不同浓度梯度的Cu离子标准溶液[27]。

1.3.5 光波的选择

选取TBZ标准液质量浓度分别为1，10和20 mg/L这3个梯度和一个空白对照（IL和乙腈混合），按照1.3.6程序操作，在光波250～490 nm波长范围内测定吸光度，根据测定结果选取最大吸收波长[28]。

1.3.6 试验操作程序

取5 mL的TBZ提取液（或标准液，TBZ标准溶液依次配制40，80，160，320，640，1280，2560和5120 μg/L）于30 mL带盖的刻度离心管中，加入450 μL 5 mg/L的Cu离子标准溶液，室温下反应生成TBZCu络合物形成后（约2 min），加入20 mg IL和400 μL乙腈萃取，加入超纯水至15 mL，用振荡器高速振荡3 min，在室温、3500 r/min下离心2 min后得到离心管底部的IL相，加入800 μL甲醇稀释后，用紫外可见分光光度计在340 nm下进行分光光度测定。试验空白值的测定为取5 mL超纯水，重复上述操作。

1.3.7 IL添加量对TBZ提取率影响的设计

选择1 mg/L的TBZ标准液作为考察对象，研究IL添加量分别为0，5，10，15，20和25 mg时对TBZ提取率的影响。以提取率高值为最佳，按式（1）计算。

式中：CIL为IL相中TBZ质量浓度，mg/L；V1为IL相体积，800 μL；C标准为TBZ标准液质量浓度，50 μg/L；V为TBZ标准液体积，5 mL。

1.3.8 乙腈添加量对TBZ提取率影响的设计

选择1 mg/L的TBZ标准液作为考察对象，IL添加量20 mg，研究乙腈添加量0，100，200，300，400，500和600 μL对TBZ提取率的影响。提取率按式（1）计算。

1.3.9 温度对TBZ提取率影响的设计

选择1 mg/L的TBZ标准液作为考察对象，在IL添加量20 mg、乙腈添加量400 μL的条件下，研究萃取温度10，20，30，40和50 ℃对TBZ提取率的影响。提取率按式（1）计算。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的确定

由图1可知，TBZ标准溶液在波长340 nm和430 nm出现最大吸收峰，340 nm比430 nm处吸光度更大，表明在340 nm处检测灵敏度更高。吸光度与TBZ质量分数相关性显著，TBZ质量分数越高，吸光度越大。

图1 不同光波下TBZ标准溶液的吸光值

2.2 pH对TBZ提取率的影响

pH会影响到TBZ与金属盐的络合，进而会影响提取率的变化。为此，在微萃取过程中选择pH进行优化。用磷酸氢二钠-柠檬酸配制pH 3.4～8.0的缓冲液，研究pH对TBZ标准溶液（1 mg/L）提取率的影响。由图2可知，在pH 3.4～5.4范围内，TBZ提取率显著增加，提取率从51.4%增加到86.4%，在pH 5.4～5.6范围内TBZ提取率最高，随着pH继续升高，TBZ提取率开始下降，pH在7.2以上，TBZ提取率下降明显，由此选择pH 5.5下提取TBZ。

图2 pH对TBZ标准溶液提取率的影响

2.3 IL添加量对TBZ提取率的影响

分散剂IL在水溶液中易形成微滴，并有助于将络合物萃取到IL相。IL添加量较小时，相分离不完全，提取率较低。考察IL添加量对TBZ标准溶液（1 mg/L）提取率的影响，由图3可知，IL添加可以显著增加TBZ提取率，IL添加量从5 mg增加到20 mg时，相分离明显增加，TBZ提取率明显增加，IL添加量增加到20 mg以上时，提取率不再增加。

图3 IL添加量对TBZ标准溶液提取率的影响

2.4 稀释剂乙腈添加量对TBZ提取率的影响

乙腈有助于IL溶解其中，并促进TBZ的络合物一起进入IL相。试验分析乙腈添加量在0～600 μL范围内对TBZ标准液提取率的影响。结果如图4所示。乙腈添加量不足400 μL时，IL分散不好，相分离不完全，TBZ提取率较低。400 μL以下时，相分离清晰，TBZ提取率显著提高。400 μL以上时，TBZ提取率不再增加。选择乙腈添加量400 μL可以实现良好的相分离，得到较高的TBZ提取率。

图4 乙腈添加量对TBZ提取率的影响

2.5 温度对TBZ提取率的影响

温度可以促进TBZ络合物溶于IL相中，试验考察萃取温度在10～50 ℃范围内对TBZ提取率的影响。结果如图5所示，温度低于20 ℃，相分离非常低，导致提取率也较低，在40 ℃范围内，TBZ提取率随温度升高而增加，40～50 ℃范围内TBZ提取率不再增加，因此选择最佳萃取温度40 ℃。

图5 温度对TBZ提取率的影响

2.6 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）对TBZ提取率的影响

PVP具有优异的溶解性和生物相容性，可以提高TBZ的检出率。试验考察3个梯度的TBZ标准液（1，0.5和0.1 mg/L）一组分别添加2 mL pH 5.5的PVP缓冲液（试验组），另一组只添加2 mL pH 5.5邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液，不添加PVP（空白组）按照1.3.6的操作程序40 ℃进行萃取，考察PVP对TBZ提取率的影响。结果如图6所示，PVP的添加明显提高3个梯度TBZ标准液的提取率，提取率较空白组提高9.3%。

图6 聚乙烯吡咯烷酮对TBZ提取率的影响

2.7 对样品中TBZ含量的检出结果

取试验对象蔬菜（黄瓜、圣女果）、水果（香蕉、橘子），3个梯度的TBZ标准（5，1和0.1 mg/L）及空白组（超纯水），按照1.3.1和1.3.6的操作程序，试验组、空白组均分别添加2 mL pH 5.5的PVP缓冲液（所有测试样做5组平行试验，空白组做1组），40℃下萃取，340 nm下检测吸光度。测定结果如表2所示，3个梯度的TBZ标准的精准度均＞98%，且具有很好的稳定性。4种蔬菜水果（黄瓜、圣女果、香蕉和橘子）中TBZ残留量分别为0.043，2.361，6.487和5.548 mg/kg，检测结果具有很好稳定性。通过向样品提供企业了解，除黄瓜样品为本地来源，采摘后没有使用过TBZ处理外，其他3种均在采摘后使用过TBZ，与实测结果对比基本吻合。对于没有使用过TBZ处理的黄瓜样品检出微量TBZ残留，推断是其生长过程中土壤吸收所致。从检测所用时间看，每个样品需要的时间在15 min左右。

表2 样品中TBZ的检出结果

3 结论

试验研究液相微萃取技术借助IL和pH 5.5的PVP缓冲液提取样品中TBZ，采用紫外-可见分光光度计作为检测手段。结果表明，TBZ在pH 5.5、IL添加量20 mg、稀释剂乙腈添加量400 μL和萃取温度40 ℃条件下具有较高得率；PVP有助于提高TBZ得率；紫外-可见分光光度计在340 nm处检测具有最高灵敏度。该方法有较好的精密度和良好的重现性，操作相对简单，试剂消耗量低，用时少，几乎任何实验室都可以使用；具有简单、快速、易于使用和成本低的优点。