乳源性骨桥蛋白安全性及生理功能研究进展

李娜，荀一萍，王永霞，朱宏，王世杰

（1.河北工程大学，河北 邯郸075000；2.石家庄君乐宝乳业有限公司 石家庄050221）

0 引 言

骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）最早发现于成骨细胞中，后被认为是哺乳动物乳汁中一类重要的生物活性蛋白[1-2]。人乳中的OPN质量浓度最高，在不同国家地域间存在显著性差异，并随着泌乳期延长呈下跌趋势，中国人母乳中OPN的中位质量浓度为266.2 mg/L，占人乳总蛋白的2.7%[3]。牛乳和以牛乳为原料生产的婴幼儿配方粉中OPN质量浓度则显著低于人乳，分别为18 mg/L和9 mg/L[4]。脐带血和三月龄婴儿血浆中的OPN水平比正常成年人高7～10倍，指示其参与了婴幼儿身体发育及免疫等多种生理过程[5-7]。为了优化婴幼儿奶粉的配方设计和评价乳OPN对早期生命的作用，国外已进行了许多研究。目前，从牛乳中分离纯化的OPN已上市，毒理学试验、动物模型和婴儿临床试验也验证了商业化牛乳OPN的安全性及其重要的生物学功能。

1 乳源性OPN生物学特征

人OPN由单拷贝基因编码，在转录过程中，可以进行选择性剪接[8]；同时，OPN还可通过磷酸化、糖基化以及蛋白酶切割作用进行翻译后修饰，因此OPN具有许多亚型[9-10]，分子质量在25～75 ku之间不等[11]。从共性上来看，乳源性OPN是一种高度磷酸化和糖基化的亲水性酸性蛋白，其上存在一个保守的调节细胞黏附RGD序列、一个SVVYGLR基序（牛：SVAYGLK）和多种蛋白酶的切割位点，见图1。这些结构为其生理功能调控提供了基础。

1.1 人及牛乳源性OPN的结构

人及牛乳源性OPN在结构上极为相似，见图1，人乳OPN含有298个氨基酸，牛型仅包含262个残基，二者61%的氨基酸一致，另外14.7%的氨基酸残基具有高度的结构相似性。目前人们对牛和人乳源性OPN的翻译后修饰已具有较为透彻的研究，首先，在磷酸化方面，人乳OPN中有36个磷酸化位点（34个磷酸丝氨酸、2个磷酸苏氨酸），牛乳OPN中约有28个磷酸化位点（27个磷酸丝氨酸、1个磷酸苏氨酸），磷酸化排列成3-5个磷酸簇，主要位于激酶FAM 20C的靶序列中[12]；在糖基化方面，牛乳OPN中靠近RGD基序的区域含有三个O-糖基化苏氨酸残基，人乳OPN除了含有以上3个糖基化位点外，还包含另外两个苏氨酸连接的寡糖，糖基化的作用目前并不明确，但它们靠近整合素结合基序的位置可能暗示了碳水化合物对内源性乳蛋白酶裂解的保护作用；最后，各种蛋白酶的水解作用也是乳源性OPN翻译后修饰的重要形式，通过蛋白酶切割，可对OPN的细胞黏附和迁移能力进行功能调控[13-15]。

图1 牛乳和人乳OPN结构比较[14-15]

图1中，磷酸化和糖基化位点分别以黑色和灰色背景突出显示。RGD序列加粗显示，SVVYGLR基序加下划线，引入的间隙用“.”表示。人乳OPN中组织蛋白酶D和基质金属蛋白酶的切割位点分别用黑色和灰色箭头在序列下标出，凝血酶和纤溶酶的切割位点分别用三角和菱形表示。

1.2 乳源性OPN与癌源性OPN的关系

乳源性OPN与癌源性OPN是同一个基因编码的不同的蛋白质。目前国内围绕OPN的研究大多集中在OPN的异常表达及其与癌症等疾病的临床病理学研究中。在临床领域，由于癌症患者血浆中OPN的水平显著升高，因此将这种异常表达的OPN作为某些癌症的诊断标志物和预后因子[16]，目前尚不清楚这种异常表达是疾病发展过程的一部分还是机体应对癌症的免疫反应[13]。可以肯定的是，肿瘤转化细胞表达的OPN与正常细胞表达的OPN具有不同的结构和功能[17]。首先，癌源性的OPN为缺少一个外显子的OPN剪接变体，而在牛及人乳OPN中，未发现任何形式的选择性剪接[18-19]。其次，大多数的肿瘤转化细胞表达低磷酸化形式的OPN[16]，而牛及人乳源性OPN均被高度磷酸化。目前无任何证据表明乳源性OPN参与了癌症的发展。并且在最近的一项研究中，荷瘤小鼠饮用添加质量浓度为300 mg/L牛乳OPN的水可以显著降低皮下肿瘤的生长速度和肿瘤大小[20]。以上事实表明，乳源性OPN与人体癌症并无直接关系。

2 乳源性OPN的安全性

目前，商业化乳源性OPN可通过分离纯化技术从牛乳中分离得到，且已通过了较全面安全性评价，未来有可能成为新的食品原料。如LacProdan®OPN-10，是一种采用阴离子交换技术从牛乳清中制备得到的乳清蛋白粉，总蛋白质量分数约78%，其中OPN占比高达95%[21]。在毒理安全性评价中，该产品在体内及体外实验中均不具有遗传毒性，摄入高剂量的该产品也未发现亚慢性毒性和致畸性，见表1。基于上述良好的试验安全性，商业化牛乳OPN已进入婴儿人群的临床实验阶段中，并取得了积极的成果[22]。市场调研结果显示，澳洲“Sunwild farm”旗下的一款婴儿营养粉中已率先添加了牛乳OPN，这预示着在不久的将来，OPN可能引领新的市场趋势。

表1 关于LacProdan®OPN-10的安全性评价及部分喂养实验

3 乳源性OPN的生理功能

3.1 增强免疫功能

母乳是0～6月龄婴儿最好的食物，母乳喂养可以帮助婴幼儿建立良好的免疫系统，这是普通婴幼儿配方奶粉无法替代的[24]，在240个母乳细胞因子相关基因中，OPN基因表达量最高，这暗示了OPN在婴儿免疫发育中的潜在作用[25]。婴幼儿配方奶粉中OPN的含量极低，为了评估在配方奶粉中添加牛乳OPN的效果，上海复旦大学招募了320名新生儿进行了一项随机临床实验，受试婴儿分别质量浓度以65 mg/L或130 mg/L（分别为人乳OPN水平的50%和100%）的剂量喂食同一种普通配方奶粉，并与母乳喂养组婴儿进行比较，结果显示，在婴儿配方奶粉中添加OPN可改变婴儿免疫细胞的组成，其中T细胞和单核细胞的比例有所增加[26]，同时婴儿血清中促炎细胞因子TNF-α显著降低，婴儿发热率以及发热天数明显减少，氨基酸代谢和细胞因子反应也更接近母乳喂养的婴儿[22]，这些结论说明了牛乳OPN在一定程度上可以等效替代人乳OPN发挥免疫促进的功能。仔猪的早产模型中发现，在奶粉中添加乳OPN可以减轻小猪发生坏死性小肠结肠炎的程度[27]，提示OPN提高免疫的能力同样适用于早产儿。

乳OPN增强免疫的机制被认为是多种免疫作用的结果。首先，OPN是诱导Th1型免疫的关键细胞因子，乳OPN可能通过诱导Th1型免疫来增强婴幼儿抵抗力，Th1免疫有助于清除细胞内病原体，证据表明，OPN敲除小鼠表现出缺陷的Th1免疫反应，比野生型小鼠更容易受到病毒和多种病原菌的感染[28-29]。其次，OPN还可直接与细菌结合，并通过整合素介导单核细胞对OPN包被菌进行吞噬。此外，人们发现乳OPN可与乳铁蛋白形成强静电复合物，每个OPN分子都能与3个乳铁蛋白分子结合，因此，OPN可能通过保护乳铁蛋白免受蛋白水解，并协同乳铁蛋白发挥免疫作用[30-31]。

3.2 促进大脑发育

婴儿期是人类大脑发育的关键时期，在这个阶段，大脑生长迅速，对营养和环境因素十分敏感。与奶粉喂养的婴儿相比，母乳喂养婴儿的认知能力显著提升，OPN就是造成这种差异的原因之一。

乳中的OPN被摄入后，可部分抵抗新生儿胃液的消化，并通过循环系统被吸收和转运至不同的组织器官中发挥作用。同位素示踪技术证明了经口摄入的乳OPN可进入至小鼠大脑，乳OPN通过上调大脑中内源性OPN的表达来促进大脑中NG-2胶质细胞的增殖分化以及中枢神经系统髓鞘的形成，这对大脑的感觉、运动和认知发育具有有利的作用，与OPN基因敲除母鼠喂养的小鼠相比，野生型母鼠喂养的小鼠在被动回避和转杆试验等行为学测试中均显示出更高的记忆和学习能力[5]。此外，OPN还具有神经保护的功能，当大脑受到损伤或刺激时，OPN有助于脑组织中星形胶质细胞的活化和脑损伤的愈合[32]，Chen认为，OPN可通过抑制caspase-3裂解和抗凋亡细胞死亡的途径，改善缺氧缺血性脑损伤新生儿的远期神经功能[33]。

3.3 刺激肠道发育

在出生后的前几个月内，婴儿的肠道经历了快速生长和分化，乳源性OPN可以改变此时期肠道基因的表达谱，改善肠道增殖和肠道免疫。体外研究表明，牛及人乳OPN可以通过触发几种不同的信号通路正向调节与肠道增殖相关的基因表达，显著促进人肠上皮细胞的增殖[34]。为了评估乳源性OPN对灵长类动物模型肠道基因表达的影响，Donovan分别使用母乳、普通婴幼儿配方奶粉和添加了质量浓度为125 mg/L牛乳OPN的配方粉喂养新生的恒河猴3个月，对其空肠mRNA进行微阵列分析，结果发现，普通奶粉喂养组与母乳喂养组之间有1017个基因存在表达差异，而OPN奶粉喂养组与母乳喂养组之间仅有271个基因差异表达，这表明在配方奶粉中添加牛OPN显著改变了肠道基因表达谱，使其更接近母乳喂养的新生儿[23]。但乳OPN在人类婴儿中是否存在类似的作用还需要进一步研究。

3.4 其他功能

乳源性OPN除了对婴幼儿的生长发育具有有益的影响外，在其它领域也具有广泛的作用。在预防龋齿方面，体外模型表明乳源性OPN通过改变口腔细菌的表面疏水性来阻止菌体黏附，并显著抑制牙齿生物膜的形成和降低该生物膜的稳定性[35-36]。在辅助生殖技术方面，使用牛乳源性OPN处理精子或成熟卵母细胞可以改善牛的体外受精、卵裂和胚胎发育[37]，这对于畜牧生产[38]甚至人类的辅助生殖技术具有借鉴作用。此外，大量研究表明，酒精喂养小鼠通过口服牛乳OPN可加强胃肠道保护功能和抗炎、抗脂肪变性的作用，进而有效预防酒精性肝病的发生，因此，乳源性OPN可作为预防和治疗酒精性肝损伤的一种简单有效的营养治疗策略[39-40]。

4 结束语

由于具有较高的安全性和对婴幼儿不可或缺的生理功能，乳源性OPN在乳品工业中有着巨大的应用前景。特别是针对婴幼儿配方食品，牛乳OPN与母乳OPN在结构和功能上相似，在婴幼儿配方食品中额外强化一定浓度的牛乳OPN可以使奶粉的成分更接近母乳，以减少奶粉喂养与母乳喂养的差异。另外，在功能性食品领域，乳OPN在提高免疫力，预防龋齿和酒精性肝损伤等方面也有一定的成人应用潜力。但目前国内对于乳OPN的研究处于起步阶段，在提取技术、功能性研究以及作用机理方面存在严重不足。因此有必要对乳OPN进行更严谨和深入的功能性和安全性评价，如剂量-效应关系等研究。