婴幼儿配方乳粉中维生素A、D的测定能力验证结果与分析

郑燕燕，朱雨田，李锦才，黎燕玲，何丽香

（深圳市计量质量检测研究院，国家营养食品质量监督检验中心（广东），深圳518131）

0 引 言

维生素A、D均属于脂溶性维生素。维生素A功能上可防止夜盲症和视力减退，同时可维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成、维持骨骼正常生长发育以及抑制肿瘤生长，缺乏维生素A可导致儿童发育不良、干眼病、夜盲症等疾病的发生[1]。维生素D功能上可防止佝偻病，同时可促进皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能作用，缺乏维生素D的儿童可患佝偻病，成人患骨质软化症[2-3]。而另一方面，维生素A、维生素D摄入过量时，也会对人体产生较大危害，由于该类脂溶性维生素不易通过尿液排出体外，容易在体内大量蓄积，从而引起皮肤、骨骼、脑、肝等多种脏器组织病变，对人体健康造成巨大影响[4-6]。GB10765-2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》及GB10767-2010《食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》均规定了维生素A和维生素D的含量范围[7-8]。维生素A和维生素D的测定在保障婴幼儿配方食品质量安全中发挥重要作用，因此开展此项能力验证工作对确保实验室维持该项检测能力在较高水平具有至关重要意义[9-11]。

婴幼儿配方乳粉基质复杂，但样品均匀性好，方便样品制备，且维生素A和维生素D在婴幼儿配方乳粉中可以稳定存在，符合能力验证样品的稳定性和均匀性要求。该项目有相应的国家标准检测方法[12]，方法成熟稳定，已被广泛采用，可以保证本能力验证项目顺利完成。本能力验证的目的是为了了解和评价目前国内婴幼儿配方乳粉中维生素A、D检测能力和水平，识别实验室间存在的差异，推动和提高参加实验室检测婴幼儿配方乳粉中维生素A、D的技术能力和水平，起到规范实验室管理的作用。

1 材料与方法

1.1 样品设计及制备

本次能力验证的测试样品为婴幼儿配方乳粉，所涉及项目为维生素A、维生素D。根据方案设计，制备3组样品（组别编号分别为A、B、C），为了尽可能地与日常检测婴幼儿配方乳粉一致，同时保证样品制备时的均匀性，由两家品牌乳粉生产商采用湿法喷雾干燥工艺制备所需样品原料。定量（40 g/包）分装，真空密封后，放入铝箔袋中封好。分装后的样品，粘贴唯一性标识，常温、避光储存。

1.2 样品均匀性检验

样品均匀性检验按CNAS-GL003:2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（以下简称“CNAS-GL003:2018”）[13]、GB/T 28043-2019《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法》（以下简称“GB/T 28043-2019”）附录B的规定[14]，从分装好的三组能力验证样品中各随机抽取10份，维生素A采用GB 5009.82-2016《食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》（以下简称“GB 5009.82-2016”）第一法进行检测，维生素D采用GB 5009.82-2016第四法进行检测。均匀性检验由同一检测人员在同一时间段使用相同测试方法、相同测试条件、同一测试仪器对抽取的每份样品进行2次测试。采用单因子方差分析法，通过F检验初步评价3组样品的均匀性，结果表明样品之间无显著差异，证明样品是均匀的，可以进行样品发放。参加实验室检测数据回收后，采用SS≤0.1δE准则再次评价样品均匀性（SS表示样品间标准差，δE表示最大允许误差），结果（SS＜0.1δE）满足均匀性的要求。

1.3 样品稳定性检验

本次能力验证项目稳定性测定方法同均匀性检验，对3个水平样品进行稳定性检验。均匀性检验符合要求后，在样品发放前和回收实验结果后两个时间点，分别从制备好的能力验证样品中各随机抽取6份样品，每份样品独立进行2次检测。稳定性检验涵盖整个计划实施周期，按CNAS-GL003:2018、GB/T 28043-2019附录B规定，采用t检验法中“二个平均值之间的一致性”方法及|x-y|≤0.1δE准则进行评定。结果表明，本次能力验证样品稳定性满足要求。

1.4 检测方法

本次能力验证推荐采用GB 5009.82-2016进行测定，每份样品报送2次平行测定结果的平均值。样品前处理偏离情况及所用仪器设备、标准物质等信息需要在结果报告单中详细说明。

1.5 样品的发放

按预先分组情况，从3组样品中的两组各随机抽取1包样品，放入粘贴有快递单的白色泡沫盒内，记录样品编号、实验室代码，核对无误后，再使用胶带进行包装，以快递的方式向各参加实验室发放考核样品。

1.6 指定值的确定

按GB/T 28043-2019附录C中算法A计算稳健平均值（x*），以x*作为本次能力验证的指定值（X）。

1.7 评价依据

（1）本次能力验证结果评价的参数为百分相对差（D%）。具体计算公式如下：

（2）判定原则。

根据GB/T 32465-2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》第7.4条及GB 5009.82-2016第7、21、28条对精密度的要求[15]。设置2倍的维生素A、D的精密度为本次能力评定百分相对差的判定限值，即20%、30%。本次能力验证判定原则设置如下：

维生素A项目：当两个样品的维生素A项目检测结果均符合｜D%｜≤20%时，结果为满意；当两个样品的任一维生素A项目检测结果符合｜D%｜＞20%时，结果为不满意。

维生素D项目：当两个样品的维生素D项目检测结果均符合｜D%｜≤30%时，结果为满意；当两个样品的任一维生素D项目检测结果符合｜D%｜＞30%时，结果为不满意。

2 结果与分析

2.1 参加实验室概况

参加本次能力验证的机构为224家（强制参加实验室有186家，自愿报名参加实验室有38家），来自全国30个省、自治区和直辖市，其中报名参加维生素A项目有221家，报名参加维生素D项目有198家。统计结果显示，有1家参加实验室未反馈维生素A测试结果，4家实验室未反馈维生素D测试结果，实际收到维生素A测试结果220项、维生素D测试结果194项。参加本次能力验证的实验室行业及地域分布情况见表1、表2。

表1 参加实验室的行业分布及占比

表2 实际参加实验室地域分布情况

2.2 能力统计结果

本次能力验证的结果数、稳健平均值、最大允许误差、稳健标准差、指定值不确定度、稳健变异系数等统计量汇总见表3。本次能力验证维生素A项目的最大允许误差为指定值的，维生素D项目的最大允许误差为指定值的。指定值不确定度ux均小于0.1δE，表明本次能力验证指定值的不确定度可以忽略不计。

表3 检测结果统计量汇总表

2.3 结果统计及评价

分别统计3组维生素A和维生素D结果分布的频率，绘制分布频率直方图，见图1～3，图中表明本次能力验证回收的结果服从单峰、近似对称分布，用稳健统计技术算法A进行数据统计分析。

图1 A组样品参加者结果直方图

本次能力验证共224家实验室参加，报名参加维生素A和维生素D的实验室数量分别为221家和198家，其中实际回收维生素A项目结果220家，结果满意实验室为182家，占结果总数的82.7%，不满意实验室为38家，占结果总数的17.3%；维生素D项目结果提交实验室共计194家，结果满意实验室为182家，占结果总数的93.8%，不满意实验室为12家，占结果总数的6.2%，具体见表4。各组维生素A、D评价情况见表5、表6。

表4 各测试项目评价情况汇总表 家

表5 各组维生素A项目评价情况汇总表

表6 各组维生素D项目评价情况汇总表

2.4 技术分析与建议

2.4.1 检测方法的差异

反馈维生素A结果的220家实验室中，有217家均采用了GB 5009.82-2016第一法对维生素A进行测定；1家实验室使用了液相色谱串联质谱法检测维生素A，但该方法的适用范围并不包含维生素A，属于使用了偏离的标准方法，且该实验室的维生素A属于不满意结果，但该实验室并未提供相关方法验证材料，无法进一步分析；2家实验室声称依据GB 5009.82-2016第三法同时对维生素A和维生素D进行了测定，但该方法不能同时检测维生素A和维生素D，属于实验室对所使用的标准发生了偏离，且其中1家实验室维生素A结果为不满意。

图2 B组样品参加者结果直方图

图3 C组样品参加者结果直方图

反馈维生素D结果的194家实验室中，有93家使用了GB 5009.82-2016第三法液相色谱串联质谱法对维生素D进行了检测，占总数的47.9%，其中结果满意的实验室占比为89.2%；有99家使用了GB 5009.82-2016第四法高效液相色谱法对维生素D进行了检测，占总数的51.0%，其中结果满意的实验室占比为99.0%；2家实验室偏离GB 5009.82-2016标准，使用同一方法同时对维生素A和维生素D进行检测，且其中1家实验室维生素D结果为不满意。

2.4.2 检测过程的质量控制

影响检测结果准确性的因素有人员、设备、试剂、方法、环境等。检测过程中要严格控制好实验条件，通过分析各参加实验室反馈的原始记录，本次能力验证测定过程中应注意以下几个方面。

（1）样品前处理操作。样品前处理是影响结果准确性的最关键因素之一，测定维生素A和维生素D时，前处理要注意避光操作，防止紫外线对结果造成干扰。皂化要充分，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。提取时，不宜剧烈振荡，容易产生乳化现象。净化过程，个别实验室采用GB 5009.82-2016第四法测定维生素D时，未按标准要求进行净化，导致较多杂质干扰目标物出峰。

（2）标准物质的影响。标准物质是实验室定量检测的准绳，其计量溯源性非常重要。建议实验室优先选用有证标准物质，使用过程中，要考虑标准物质的纯度、有效期、储存方式及目标成分变化等。同时，在配制标准溶液时，使用的移液管、容量瓶等要经过检定且满足要求。配制好的维生素A、D标准储备液，在使用前一定要按GB 5009.82-2016附录B的要求校正后使用。部分实验室未对配制的维生素A、D标准储备液进行校正。标准曲线浓度范围应覆盖试样的测定值，某些实验室计算维生素A含量时超出了线性范围。

（3）仪器设备。仪器设备测试条件的优化是影响结果准确性的重要因素。有个别实验室没有做好仪器条件的优化，导致目标物与杂质的峰分离度不够，不能满足准确定量的要求。个别实验室测定维生素A、D时，色谱峰明显有杂峰干扰，目标峰与杂峰未明显分开；个别实验室选择维生素D2作为内标，利用内标法对结果进行定量，但是维生素D2与维生素D3未完全分开。这些都可能会影响定量结果的准确性。

（4）检测方法。应严格按照所选择的方法进行测试，如发生偏离时应对方法进行确认，个别实验室偏离了所选择的方法，且未使用质控样品或加标回收予以确认。部分实验室使用GB 5009.82-2016第三法检测维生素D，但并未按标准要求使用内标、标准曲线进行计算，而是偏离标准采用外标法或单点校正计算结果。对平行样的精密度控制也尤其重要，个别实验室上报的同一样品的精密度不满足方法要求，说明实验室内重复性有问题。

2.4.3 参加者结果误差分析

从统计结果可以看出，某些实验室检测维生素A或维生素D时，其各自的两份样品结果存在较为一致的正偏倚或负偏倚，通过对实验室提供的原始记录等材料审核发现，个别实验室偏离标准，方法误差可能是造成较大一致性偏倚的原因之一。因实验室提供材料有限，无法进一步分析判断。对于结果出现一致性较大偏倚的实验室，建议应从方法、仪器、试剂、人员操作等可能存在的系统误差对结果进行分析，及时找出可能存在的问题。

3 结 论

从本次能力验证结果来看，我国大多数检验检测结构的检测结果是满意的，从参加者提供的原始记录来分析，其检测能力均基本符合要求。产生不满意结果的主要原因包括仪器设备测试条件、对方法理解、标准物质配制、样品前处理等方面。本次能力验证部分实验室结果出现不满意情况，建议这些实验室参照技术报告给出的信息，根据相关的标准和规范，结合自身的实际，认真对本实验室的数据进行评估，真正找出差距和问题所在，制定纠正措施，有效整改，对检测结果进行有效的质量控制，持续保持和提高技术能力及管理水平。