高效液相色谱-蒸发光散射法测定母乳及牛乳中5种磷脂质量浓度

梁雪，田芳，蔡小堃，毛颖异，Nick A.Cellar，赵艳荣，朱惠莲

（1.雅培营养中国研发中心，上海200233；2.中山大学公共卫生学院营养学系，广州510080；3.雅培营养品，美国 哥伦布OH 43219）

0 引 言

磷脂是一类存在于生物界的含磷脂质，母乳和牛乳中磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰肌醇（PI），磷脂酰丝氨酸（PS），磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM）5大类[1]。目前，乳制品磷脂总含量的测定主要采用称重法[2-3]、比色法[4]、紫外分光光度[5]和红外光谱(FTIR)法[6]等，而磷脂不同组分的分离和测定的方法有薄层层析色谱法（TLC）[7]、核磁共振波谱法（NMR）[8]和高效液相色谱法（HPLC）[9-10]和液相色谱串联质谱法(LC-MS)[11]。HPLC-ELSD法普遍用于检测牛奶、乳制品[12-18]和母乳[19-20]的磷脂，而检测母乳中磷脂的研究中，只有Giuffrida等人[20]对母乳基质中的方法进行验证，但没有提供磷脂的检测限（LOD）和定量限（LOQ）的数据信息，并且PI和PS的分析范围可能需要改进，以满足母乳中这两种较低水平磷脂的定量测定需要。因此，建立磷脂含量的准确、高效及简便的测定方法是目前仍需解决的问题。

本文建立并优化HPLC-ELSD法测定母乳和牛乳中5种磷脂质量浓度及构成，该方法操作简便快速、精密度好、回收率高，对乳制品种磷脂的定量检测提供参考依据。

1 实 验

1.1 试剂耗材与仪器

三氯甲烷，HPLC级，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，Thermo Fisher；甲酸、氯化钠，anpel；三乙胺，Sigma-Aldrich）。

高效液相色谱仪（HPLC），Agilent1260；配置蒸汽发光检测器（ELSD）Agilent1260，Agilent；色谱柱BETA SIL silica-100（200×3 mm，3μm），Thermo Fisher；Thermo REL5004V冰箱，Thermo Fisher；Gilson移液枪，Gilson；PTFE滤膜（13 mm×0.2μm），Agilent。

1.2 标准品

PI，P0639-25M G（PI钠盐），≥99%；PE，P7943-25MG（来自蛋黄），≥97%；PC，P3556-100MG（来自蛋黄），≥99%；SM，85615-50MG（来自蛋黄），≥98%；PS，P7769-25MG（来自牛脑），≥97%；均来自Sigma公司。

1.3 样品

母乳样品：广州地区成熟乳（n=10，产后天数40～45 d）,母乳样品从广州中医药大学祈福医院收集（全段乳）；

牛乳样品（液态乳）：包括膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂牛乳、巴氏杀菌脱脂牛乳、超高温瞬时灭菌（UHT）全脂牛乳、超高温瞬时灭菌（UHT）低脂牛乳购于当地市场，详细信息见表1。

表1 牛乳生产基本信息

1.4 方法

1.4.1 标准曲线的制作

（1）配制储备液。取标准品PE，PI，PS，PC，SM（均取25.00 mg，精确到0.01 mg），加溶剂氯仿/甲醇（9∶1）混合液，用容量瓶定容（PE，PS，PC，SM 10 mL，PI50 mL），配置成储备液。

（2）配制系列混合标准工作液。混合标准储备液的配制：分别取0.5 mL PC储备液，0.5 mL PS储备液，0.5 mL PE储备液，0.5 mL PS储备液，1.5 mL PI储备液于玻璃管中，用移液管移取，充分混匀。

表2 系列混合标准工作液的配制

（3）绘制标准曲线。将磷脂混合标准系列测定液依次进行HPLC色谱测定。记录各组分的色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.2 乳样中磷脂的测定

参考Lopez等人[13]的方法，取250μL乳样（母乳/牛乳，每组样品都检测相同的一个平行样，检测结果取平均值，以保证结果的稳定性及准确性），加入250μL的水和9.5 mL氯仿-甲醇混合液（2∶1，体积比），放入50 mL玻璃管中，涡旋充分混匀。样本溶液放入超声波振荡器中40℃超声15 min，取出样本溶液并加入2 m L的饱和氯化钠溶液，涡旋混合30 s以上，充分混匀。离心（2 000 r/min，5 min），出现分层（上层为水相，下层为有机相），用玻璃滴管将下层有机相转移到玻璃顶空瓶中。玻璃管剩余溶液加氯仿-甲醇混合液（6∶1，体积比）7 m L再次提取，涡旋30 s以上，充分混匀。再次离心(2 000 r/min，5 min)，吸取下层有机相溶液合并于顶空瓶中。在40℃水浴中氮吹将溶剂蒸发至干，样品溶于250μL氯仿-甲醇混合液（9∶1，体积比），涡旋充分混匀，通过0.2μm×4 mm PTFE滤膜过滤，转移到进样小瓶，进行HPLC-ELSD分析。色谱柱为BETA SIL silica-100（200 mm×3 mm，3μm），柱温为40℃，进样量为25μL，ELSD检测器蒸发温度为85℃，喷雾温度为40℃,流速N2为1.4 L/min，流动相A为三氯甲烷-甲醇-甲酸（浓度1 mol/L，三乙胺调p H=3）（87.5∶12∶0.5，体积比），流动相B为三氯甲烷-甲醇-甲酸（浓度1 mol/L，三乙胺调p H=3）（28∶60∶12，体积比）。HPLC参考色谱梯度洗脱程序见表3。

表3 HPLC参考色谱梯度洗脱程序

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0进行数据处理与分析。采用单因素ANOVA的多重比较来评估多个样本间数据差异的显著性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 方法验证

本研究选用广州地区收集的3例成熟母乳（40～45 d）样品充分混匀，做为方法验证的基质样品，对所建立的磷脂分析方法的检出限（LOD）、定量限（LOQ）、分析范围、精密度及准确性进行了全面的验证。

2.1.1 标准曲线分析范围，检出限与定量限

使用标准系列混合工作液建立校准曲线，根据母乳样品中各磷脂的质量浓度水平确定合适的分析范围。5种磷脂在验证的质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999，分析范围以mg/L母乳样品表示。待测样品的色谱峰信噪比为3时对应的浓度为本方法磷脂的检出限（LOD），以信噪比为10时对应的浓度为本方法磷脂的定量限（LOQ），经过计算得出，本方法的检出限（LOD）范围为0.69～2.97 mg/L，定量限（LOQ）范围为2.29～9.90 mg/L，在此范围内，分析方法具有良好的灵敏度，可以满足母乳样品中5种磷脂的定量检测，见表4。

表4 磷脂的分析范围及相关系数 g/L

2.1.2 精密度与准确性

选用广州地区成熟乳制备混样（n=3，产后天数40～45 d）（乳样品是当天收集分装，保存在-80°C冰箱。混合样品是将样品解冻充分混匀，分装保存在-20°C冰箱），计算此混样中各磷脂8天16次测定结果的平均值及标准偏差，5种磷脂检测结果的RSD的范围在2.73%～10.03%之间，说明此方法具有良好的精密度。以此样品做为基质，选用3个不同的磷脂质量浓度水平（分别为基质本底质量浓度的50%、100%和150%）进行加标回收试验，研究每个浓度水平3天6次检测结果的平均回收率，以验证此方法的准确性。5种磷脂在3种浓度水平的加标回收率均在80.17%～101.81%之间，总磷脂含量的回收率在90.06%～91.37%之间，说明此方法具有良好的准确性，能够满足磷脂分析的要求，验证结果见表5。

表5 磷脂测定方法精密度和加标回收率的验证结果

2.2 母乳和牛乳的测定与分析

采用上述方法对广州地区收集的10个成熟乳样品（40～45 d），以及5种市面上常见的牛乳样品（膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂牛乳、巴氏杀菌脱脂牛乳、UHT全脂牛乳、UHT低脂牛乳）的磷脂质量浓度进行测定，见表6。对母乳和牛乳磷脂质量浓度进行单因素ANOVA分析，再采用LSD进行两两比较。

母乳样品的总磷脂质量浓度显著高于3种不同生产工艺的全脂牛乳（膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂牛乳、UHT全脂牛乳）（P＜0.05），表现为母乳SM的质量浓度约是3种全脂牛乳SM的2.1倍；3种全脂乳之间总磷脂质量浓度无显著差异（P＞0.05）；对于同一生产工艺的牛乳来说，全脂牛乳总磷脂的质量浓度大于脱（低）脂牛乳（P＜0.05），表现为全脂牛乳PE、PC和PI的质量浓度约是脱脂牛乳的1.6倍；不同工艺生产的脱（低）脂乳无差异（P＞0.05）。

对于母乳和牛乳磷脂的构成比，采用卡方检验进行分析，母乳磷脂与3种全脂牛乳之间、不同生产工艺的全脂乳之间、同一生产工艺的脱（低）脂牛乳和全脂牛乳脂检均无差异（P＞0.05），因此母乳和牛乳磷脂的构成比无统计学差异。经过多重比较，母乳与牛乳中PE和SM的百分含量差异显著，成熟乳中的PE的构成比比牛乳低大约10%，而SM的构成比比牛乳高大约10%。结果表明，母乳磷脂与牛乳磷脂组成相似，其中以PE、PC和SM为主(约占磷脂总量的80%)。而3种优势类型的磷脂在母乳中的比值为PE∶PC∶SM=1.2∶0.8∶1.0，牛乳中的比值为PE∶PC∶SM=2.6∶1.6∶1.0。结果如表7所示。

表7 不同地区母乳磷脂的质量浓度及构成比

图1 母乳和牛乳中磷脂构成比的比较

3 讨 论

本研究显示，PE、PI、PS、PC和SM的分析范围分别为11.9～142.9，9.5～57.2，11.5～69.1，14.2～113.6 mg/L和13.6～109.0 mg/L，定量限分别为4.1，9.9，6.3，4.3 mg/L和2.3 mg/L。这表明建立的方法灵敏度较高，可以对母乳和全脂牛乳中的5类磷脂进行定量分析，见表6。将样品量增加到0.5 mL来检测脱脂牛乳中的磷脂，以确保其检测结果在方法分析范围内。该方法步骤相对较少，简化了样品制备过程，适用于大样本量的常规分析。

表6 母乳和牛乳中磷脂质量浓度 mg/L

分析方法、地理差异、样品采集季节、哺乳期、胎龄、饮食等因素均可导致磷脂质量浓度和组成的差异。用建立的HPLC-ELSD法测定母乳中总磷脂的平均质量浓度为204.5±9.4 mg/L(n=10)，本研究结果位于世界各地报道的结果范围内，且与新加坡早期成熟乳的研究结果比较接近（具体数据见表7）。关于母乳的构成，本研究结果显示，成熟乳中磷脂的构成以PE为主，其次是SM和PC，与日本早期成熟乳的研究结果相似，而在新加坡、德国和西班牙等地的研究中发现，SM在早期成熟乳的构成中起主要作用。

本研究结果表明，不同的生产工艺，包括UHT、巴氏杀菌和膜过滤，对牛乳中磷脂的质量浓度和构成没有显著影响。膜过滤是一个相对温和的处理过程，而巴氏杀菌和UHT则要经过一定的热处理。本研究结果表明，在牛乳热处理过程中，磷脂是一类相对稳定的活性物质，磷脂是乳脂球膜(M FGM)的重要组成部分，同时具有亲油性和亲水性，有一定的乳化作用。有研究报道存在于乳化液中的磷脂对整个乳化体系的热稳定性有提升作用[22]，而分离出来的MFGM（富含磷脂）在空气中储存期间会经历严重的氧化反应[23]。所以，磷脂的稳定性会受到多方面因素的影响，与其存在的基质和氧化条件密切相关。脱脂牛乳是通过去除全脂牛乳中的乳脂来生产的，Deeth等人[24]报道，脱脂奶中也含有膜成分，其含量和组成均与MFGM相似。本研究结果也表明，脱脂后的牛乳中仍有约60%的磷脂残留在乳液中，且磷脂组成与全脂牛乳相似。这些都使牛乳及其加工制品（乳脂肪、乳粉等）成为婴儿配方奶粉中磷脂的良好来源，为其提供与母乳相似的营养价值。

4 结 论

本研究建立的HPLC-ELSD方法具有良好的准确性和精密度，方法的分析范围、检出限和定量限均能满足母乳和牛乳中磷脂的检测要求。建立的方法适用于母乳和牛乳中5种磷脂(PE、PI、PS、PC、SM)的测定。该方法的应用表明，该方法是常规分析中快速、准确地鉴定和定量5类磷脂的可靠的方法。全脂牛乳的总磷脂质量浓度略低于早期成熟母乳(40～45 d)，而牛乳的磷脂构成与母乳相似。这表明牛乳是一种很好的磷脂来源，可以为婴儿配方奶粉提供这些重要的活性营养素，其质量浓度和构成与母乳相似。