有机酸的HPLC检测方法优化及其在白茶检测中的应用

田宇倩，刘天然，范方媛，龚淑英，宋楚君

（浙江大学茶叶研究所 杭州 310058）

有机酸是茶叶中重要的呈味成分之一。有研究显示，茶叶中含有近30 种有机酸，主要分为两大类：一类是含有环状结构的脂肪酸，如奎尼酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸等[1]，其中有些化合物如乙烯酸等本身就是茶叶香气成分，有些化合物如亚油酸等自身虽无气味，但经氧化可转变为香气物质。另外一类是二元酸和羟基多元羧酸，例如：琥珀酸、柠檬酸、酒石酸等，这类化合物作为水溶性物质，在茶叶冲泡过程中大多数可被浸出到茶汤中影响茶汤滋味。茶叶中有机酸含量约占茶叶干物质的3%[2]，有机酸对茶叶体内物质的形成和转化有着重要作用，作为茶叶中一些滋味成分和香气成分的前体或中间产物，影响着茶叶品质的形成。

茶叶有机酸的分析方法主要有滴定法、原子吸收法、气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法等，其中高效液相色谱法（HPLC）具有简单、快速、稳定的优点，在有机酸检测应用中愈加普遍。刘盼盼等[2]采用HPLC 方法，以KH2PO4作为流动相，可以检测茶叶中的草酸、奎尼酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、柠檬酸等6 种有机酸含量。刘盼盼等[3]优化了有机酸HPLC 检测条件，以0.02 mol/L 磷酸二氢钾（pH 2.8）为流动相，检测了茶树鲜叶中的草酸、奎宁酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗坏血酸、没食子酸等10 种有机酸含量。何水平等[4]采用HPLC方法，以3%甲醇-0.05 mol/L KH2PO4为流动相检测白毫银针、高级白牡丹、寿眉茶中苹果酸、草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸等8 种有机酸的含量。

茶叶中的有机酸含量易受品种、嫩度、茶叶加工工艺及储藏条件等多种因素影响，对茶叶不同品质风格的形成有重要作用。有机酸作为植物组织内多种代谢途径的联系纽带，其代谢状态与多种品质成分代谢相关。萎凋工艺是红茶、乌龙茶及白茶等多种茶类加工的首要工序，该过程是制叶散失水分的过程，也是叶片内含物质如多酚类化合物等发生一系列化学变化的过程，奠定了后续制茶工序的物质基础。目前研究中针对离体茶树鲜叶呼吸作用的研究较少。研究茶叶萎凋过程中有机酸代谢调控，不仅能够探明茶叶中有机酸对其品质形成的作用，进一步完善茶叶品质形成机理，而且通过明确萎凋工艺因子对有机酸代谢的调控机制，对实际生产中制茶工艺提升提供理论依据。

本研究优化有机酸的高效液相色谱检测方法，并用该方法研究不同嫩度等级的白茶中有机酸含量的差异，以及不同品种鲜叶制作白茶萎凋过程中有机酸的含量变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬酸（分析纯，纯度≥99.5%）、乙酸（色谱纯，纯度≥99.9%）、乳酸（色谱纯，纯度≥98%），阿拉丁试剂公司；L-酒石酸、草酸、奎尼酸、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、丙酮酸等标准品（均为色谱纯，纯度≥98%），源叶生物公司；磷酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（分析纯，99.5%）、甲醇（色谱纯，99.9%），阿拉丁试剂公司；水为超纯水。

白茶嫩度等级样品：2013、2014年的白毫银针、白牡丹、贡眉、寿眉样品共8 个。

白茶工艺试验样品：2017年4月采用鸠坑（品种1）、鸠坑早（品种2）茶树品种加工白茶，采摘嫩度为一芽二叶。工艺过程样品均采用微波固样。

1.2 仪器与设备

PB-10 型pH 计，德国Satorius 公司；Millipore超纯水机，美国Millipore 公司；Mettler AE200 电子天平，瑞士Mettler 公司；CHB-IIIA 型循环水式多用真空泵，上海豫康科教仪器设备有限公司；KQ5200DE 型数控超声波清洗机，上海昆山市超声仪器有限公司；HWS28 电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；Micro CL21R 微量台式离心机，德国Thermo Scientific 公司。HPLC 系统包括：LC-20A 高效液相色谱仪，日本岛津公司；Waters Atlantis T3 柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）附带Waters Atlantisd C18保护柱（4.6 mm×20 mm，3 μm）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制 分别准确称取各有机酸标准品，用超纯水溶解并定容，配制成单个标准品母液，质量浓度分别为草酸14.50 mg/mL，奎尼酸10.70 mg/mL，乳酸11.50 mg/mL，乙酸14.20 mg/mL，酒石酸7.10 mg/mL，丙酮酸16.65 mg/mL，苹果酸9.80 mg/mL，柠檬酸25.45 mg/mL，琥珀酸11.8 mg/mL，延胡索酸0.25 mg/mL。准确量取标准品母液并稀释10 倍，形成所测有机酸样品单标标品。

将上述有机酸溶液混合，再分别稀释2，4，8，16，32 倍，配制成6 种梯度浓度混合对照标准溶液。标准品溶液用0.22 μm 滤膜过滤，后置于-20℃冰箱保存。

1.3.2 标准曲线绘制 取6 种梯度浓度混合对照标准溶液，按照本文所优化的色谱分析条件，分别进样5 μL，以峰面积（Y，μV·S）对质量浓度（X，mg/L）作图，绘制标准曲线，得到10 种有机酸类物质的线性范围、线性回归方程及相关系数。以仪器信噪比（S/N）确定有机酸的最低检出限（Limit of detection，LOD，S/N=3），同时确定最低定量限（Limit of quantification，LOQ，S/N=10）。

1.3.3 样品准备方法 准确称取1.00 g 茶叶粉碎样置于100 mL 锥形瓶中，加沸水50 mL，在100℃沸水浴中浸提45 min（每隔10 min 摇晃1 次），趁热过滤，并用热水洗涤茶渣，过滤2～3 次，冷却后加水定容至100 mL，取出20 mL 在4 ℃条件下离心15 min，转速12 000 r/min。之后再用0.22 μm滤膜过滤，滤液置于-20 ℃冰箱中保存。

2 结果与分析

2.1 有机酸检测的优化

对有机酸HPLC 检测条件的优化对比结果如图1所示。全波段扫描对比（图1a）显示本研究检测的10 种有机酸化合物均在210 nm 波长处有较大吸收，且重复性好，因此选择210 nm 为检测波长，与已有文献研究结论[2]一致。

图1 检测条件对有机酸分离度及保留时间的影响Fig.1 Influence of detection conditions on separation degree and retention time of organic acids

依据相关文献研究[2，5]，本研究选择比较流动相成分 KH2PO4、KH2PO4+CF3COOH、HCOONH4、NaH2PO4、H3PO4等对有机酸标准化合物混合溶液的分离效果的影响，结果显示以KH2PO4作为流动相的各化合物分离效果相对最好。

比较不同KH2PO4溶液浓度（10，20 mmol/L）发现，二者对有机酸分离效果均较好，然而，由于高浓度盐溶液不利于色谱柱的使用和保存，因此选择10 mmol/L 的KH2PO4溶液作为本研究检测方法的流动相。

流动相pH 值（2.75，2.65，2.55）对有机酸混标中各物质分离的影响的对比研究显示，在pH 2.65 时，苹果酸与乳酸之间的干扰峰消失，草酸、酒石酸、奎尼酸、丙酮酸之间及柠檬酸、延胡索酸分离度较好。由于过低的流动相pH 值会影响色谱柱效及使用寿命，故本试验选择pH 2.65 为后续研究条件。

有研究显示流动相中添加甲醇、乙腈等能够改善峰形[6]，本研究条件下对比显示添加甲醇（1%～5%）和乙腈（1%～5%）均会使有机酸峰形靠拢，影响某些有机酸的分离度，因此本方法流动相中不添加甲醇和乙腈。

不同流速（0.5，0.7，0.8，1 mL/min）条件下对比显示，流速较小导致峰形较宽，易产生拖尾现象；流速较大同样降低分离度，同时显著增加柱压，因此本研究条件下选择0.8 mL/min 为洗脱流速。

对比不同检测柱温（25，30，35 ℃）对有机酸物质洗脱分离的影响显示，随柱温逐渐上升，有机酸出峰总时间缩短，峰形变得紧密，本试验条件下柱温30 ℃时有机酸分离度较高。

对本研究有机酸HPLC 检测方法的定量检测检验结果如表1所示。10 种有机酸浓度与峰面积呈线性相关，线性良好，检测限在0.000025～0.074 mg/mL 之间。日间稳定性及日内稳定性良好，相对标准偏差（RSD）分别在0.4%～3.5%范围内。加标回收试验显示10 种有机酸回收率均在92%～107%范围内（表1），即本研究的有机酸HPLC 检测方法稳定性，重复性及回收率均较好，可用于样品的有机酸定量检测。

表1 10 种有机酸的线性方程、相关系数、检测限、稳定性、加标回收率和精密度（n=6）Table 1 Linear equations，correlation coefficients，detection limits，adding standard recoveries，precision and stability of 10 organic acids（n=6）

综上，本研究条件下最终确定有机酸HPLC检测条件为：采用Waters Atlantis T3 柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）附带Waters Atlantisd C18保护柱（4.6 mm×20 mm，3 μm）等度洗脱，流动相为10 mmol/L 的KH2PO4，pH 2.65，洗脱时间15 min，流速0.8 mL/min，进样量5 μL，检测波长210 nm，柱温30 ℃。本方法可同时检测10 种有机酸，出峰顺序为：草酸、酒石酸、奎尼酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸（图2）。

图2 最终有机酸混合标准品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of organic acid standards

2.2 不同等级白茶有机酸定量检测结果

采用上述有机酸HPLC 定量检测方法对2013年及2014年不同等级的白茶样品（白毫银针、白牡丹、贡眉、寿眉）中有机酸进行定量检测，结果如表2所示。结果表明，在本研究试验条件下，不同等级白茶主要有机酸总量在白牡丹中最高，其次是白毫银针，在寿眉中最低。不同等级有机酸总量在54.32～87.83 mg/g 和72.31～87.69 mg/g 之间，柠檬酸和奎宁酸是影响有机酸总量变化的主要成分。

量总酸珀琥酸索胡延77.46±0.47ab 2.93±0.01b 0.10±0.00a 87.83±3.47a 4.08±0.10a 0.08±0.01a 75.04±4.37b 3.92±0.06a 0.11±0.02a 54.32±1.40c 3.08±0.05b 0.10±0.01a 82.15±0.90ab 3.55±0.01a 0.11±0.00a 87.69±4.73a 2.72±0.52ab 0.13±0.04a 80.18±0.61ab 2.13±0.06b 0.08±0.00a 72.31±1.02b 2.66±0.01ab 0.07±0.00a）（mg/g量含酸机有的茶白度嫩同不2表）（mg/g Organic acid content of white tea with different tenderness Table 2 酸檬柠酸乙酸果苹酸酮丙酸尼奎酸石酒酸草30.61±0.32b 1.84±0.02b 1.21±0.16b 0.71±0.05a 26.51±0.32ab 3.35±0.20a 5.42±0.34b 36.96±0.80a 2.38±0.02a 1.04±0.01b 0.18±0.11b 29.82±3.38a 3.35±0.44a 5.90±0.02ab 26.48±1.17b 2.35±0.04a 1.14±0.04b 0.17±0.10b 27.29±2.29ab 3.37±0.25a 6.48±0.34a 18.13±1.60c 0.88±0.00c 2.38±0.08a 0.18±0.02b 21.03±0.49b 2.35±0.05a 2.48±0.14c 31.51±0.02a 2.02±0.00ab 3.56±0.33b 0.68±0.06a 26.23±1.05b 3.58±0.02a 5.75±0.11b 29.14±3.52a 2.18±0.38a 4.17±0.01b 0.38±0.04b 34.01±0.21a 3.31±0.21ab 7.52±0.02a 25.27±0.35a 1.73±0.04ab 4.77±0.61ab 0.33±0.01b 31.55±1.31a 2.60±0.23b 7.52±0.45a 16.22±0.09b 1.35±0.03b 5.90±0.30a 0.27±0.01b 34.25±0.73a 3.06±0.22ab 4.90±0.08b。同（P=0.05），下著显异差验检LSD 法经示度嫩针银丹牡眉贡眉寿针银丹牡眉贡眉寿表母字同份年2013 2014不列：同注

本研究检测的有机酸中，丙酮酸、乙酸、柠檬酸含量随嫩度下降而呈下降趋势，苹果酸呈上升趋势，草酸在中等嫩度的白茶中含量较高。奎尼酸、柠檬酸在白茶中较其它有机酸含量高，与刘盼盼等[7]关于茶树生长期对茶叶有机酸含量的研究及高木满[8-9]对茶树奎宁酸含量研究结果一致。柠檬酸是白毫银针中含量最高的有机酸成分，平均含量为31.06 mg/g，占10 种有机酸总量的41.53%；寿眉中柠檬酸含量显著低于其它等级。奎尼酸约占有机酸总量的39.76%，含量较高。奎尼酸在不同嫩度等级中含量差异不显著，在嫩度居中的白牡丹和贡眉等级中含量稍高（31.92，29.42 mg/g），然而奎尼酸在有机酸总量中的占比随嫩度等级降低而呈上升趋势，推测可能由于奎尼酸在茶叶体内由儿茶素类的前体脱氢奎尼酸的酶作用生成[5]。在芽中，儿茶素的合成使奎尼酸偏向消耗方面转化，而在茎中使奎尼酸朝合成方向转化[8]，嫩度等级越低的茶茎含量更多，故奎尼酸含量占比更高。乙酸在白牡丹中含量最高，在寿眉中含量显著低于其它等级。丙酮酸在白毫银针中含量显著高于其它等级，随嫩度降低其含量有下降趋势。丙酮酸在嫩度高的白茶中含量最高，推测可能由于萎凋过程中三羧酸循环受阻导致丙酮酸积累。乙酸和丙酮酸与茶叶香气合成有关，而嫩度较低的茶叶香气及滋味较粗淡，可能与乙酸和丙酮酸含量较低有关。苹果酸在寿眉中含量最高，且随嫩度等级降低而逐渐增加，与何水平等[4]和吕海鹏等[10]关于白茶中有机酸含量的研究报道一致，推测可能与寿眉原料较为粗老有关，苹果酸作为三羧酸循环的末端产物，代谢相关酶活性变化造成苹果酸积累[11]。

量总酸珀琥酸索胡延128.85±2.02a-0.10±0.00b 119.62±0.2b-0.10±0.00b 68.77±1.02c-0.10±0.00b 70.41±1.28c-0.11±0.00a 73.30±0.31c-0.11±0.00a 37.36±0.10c-0.20±0.01a 48.62±0.33a-0.12±0.01c 42.89±0.61b-0.17±0.01b 50.12±0.43a-0.17±0.00b 44.23±1.46b-0.19±0.00ab）（mg/g量含酸机有的中程过凋萎茶白3表）（mg/g Organic acid content in the process of white tea withering Table 3 酸檬柠酸乙酸果苹酸酮丙酸尼奎酸石酒酸草83.53±0.98a 0.69±0.02d 1.01±0.21c 0.34±0a 31.58±1.08c 6.80±0.25a 4.80±0.02d 64.17±0.33b 1.31±0.03c 3.00±0.23a 0.20±0b 39.84±0.35a 5.18±0.07b 5.80±0.02c 30.33±0.51c 1.54±0.02b 2.05±0.32b 0.32±0.03a 26.43±0.17d 1.54±0.07c 6.46±0.01b 27.19±0.95d 1.52±0.01b 1.17±0.02c 0.40±0.04a 31.88±0.29bc 1.57±0.05c 6.57±0.16ab 27.67±0.07d 1.66±0.03a 1.39±0.02bc 0.32±0.02a 33.80±0.28b 1.61±0.03c 6.74±0.00a 5.91±0.10c 1.02±0.05c 4.33±0.12b 1.27±0.05a 17.35±0.4c 2.48±0.04ab 4.82±0.03c 8.33±0.08b 1.55±0.03a 6.92±0.22a 0.78±0.02d 2.36±0.02abc 22.96±0.16a 5.63±0.15b 6.39±0.01c 1.15±0.02b 4.34±0.24b 1.02±0.01bc 21.25±0.4b 2.09±0.14bc 6.49±0.07a 13.14±0.11a 1.09±0.03bc 3.51±0.05c 1.11±0.03b 22.33±0.48a 2.11±0.08c 6.66±0.02a 6.40±0.36c 1.03±0.02bc 3.30±0.21c 0.97±0.03c 22.96±0.51a 2.51±0.16a 6.56±0.38a凋萎/h间时6 11 22 25 28 0 18 27 30 42种品1种品2种品

2.3 萎凋过程中白茶有机酸定量检测结果

萎凋是白茶加工的关键工艺，是利用自然条件或人工辅助设施使离体后的新稍适时、适度失水，该过程涉及离体胁迫及干旱胁迫等逆境应激反应[12]。已有研究显示，在细胞缺水状态下，植物细胞壁会变薄，渗透势改变，有机酸含量增加[13-15]。目前针对白茶萎凋过程中有机酸含量变化的研究较少。本研究显示，在白茶萎凋过程中，各有机酸含量在萎凋过程总时长的前2/3 时段内有较大波动，之后趋于稳定，推测萎凋前2/3 时段为有机酸代谢转变的活跃时期。主要有机酸含量变化与茶树品种呈现密切相关，主要体现在不同品种的萎凋程度表现时间不一致。品种1 有机酸总量在萎凋前22 h 内显著下降，降幅约46.62%，之后呈稳定趋势。品种2 在萎凋的前27 h 内有阶段性上升，随后下降，27 h 后相对稳定。

图3 鸠坑、鸠坑早品种制作白茶萎凋过程中部分有机酸含量的变化Fig.3 Changes of organic acid content in jiukeng and jiukengzao white tea during withering

不同有机酸化合物中，草酸、奎宁酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、延胡索酸在不同品种制叶萎凋过程中，随萎凋程度变化其含量变化趋势较为一致。其中草酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸在萎凋前半程含量显著上升，丙酮酸、延胡索酸在萎凋全程先降后升，而苹果酸在萎凋全程先升后降。草酸含量随萎凋程度的加重而增加，与赵宽[13]对油菜、诸葛菜和桑树在干旱胁迫下的含量变化有相同趋势，推测由于茶叶萎凋过程与植物干旱胁迫应激反应相似，有机酸分泌与细胞缺水改变细胞水势，从而改变细胞渗透势相关。丙酮酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸在萎凋全程呈波动变化，推测与三羧酸循环有关。茶树叶片脱离茶树本体后，生物活性降低，有机酸参与的糖酵解减弱，导致丙酮酸形成速度小于消耗速度，含量下降。三羧酸循环受阻，中间产物积累，在萎凋18 h 内，苹果酸显著上升。随后，叶片生物活性持续降低，柠檬酸消耗减少，糖类继续分解，柠檬酸含量降低而丙酮酸含量上升。

3 结论与讨论

本研究优化了一种茶叶中有机酸的HPLC 检测方法，利用Waters Atlantis T3 柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）色谱柱，以10 mmol/L KH2PO4（磷酸调pH 值至2.65）为流动相等度洗脱，流速0.8 mL/min，进样量5 μL，检测波长210 nm，柱温30 ℃。可同时分离茶叶中草酸、酒石酸、奎尼酸、丙酮酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸等9 种有机酸，结果显示9 种有机酸浓度与峰面积呈线性关系，具有较好的回收率和精密度，同时稳定性、分离度较好，可满足实际样品的检测要求。

同时采用上述优化方法对不同原料嫩度等级的白茶样品、白茶萎凋工艺过程样进行有机酸含量测定，研究嫩度对白茶有机酸含量的影响及白茶萎凋过程中有机酸含量的变化。结果表明，在本研究试验条件下，原料嫩度对白茶有机酸含量有一定影响，嫩度适中（一芽一叶）的原料制得白茶有机酸含量最高，粗老原料所制白茶有机酸含量最低，柠檬酸、奎宁酸是影响有机酸总量变化的主要成分。本研究检测的有机酸中，丙酮酸、乙酸、柠檬酸含量随嫩度下降呈下降趋势，苹果酸呈上升趋势，草酸在中等嫩度的白茶中含量较高。本试验所用白茶样品有一定存储年份，与新茶可能存在一定差异，试验中原料嫩度对酒石酸、延胡索酸的影响尚不明确，未来可继续深入研究。

本研究显示，在白茶萎凋过程中，各有机酸含量在萎凋过程总时长的前2/3 时段内有较大波动，之后趋于稳定，推测萎凋前2/3 时段为有机酸代谢转变的活跃时期。主要有机酸含量变化与茶树品种密切相关，主要体现在不同品种的萎凋程度表现时间不一致。其中草酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸在萎凋前半程含量显著上升，丙酮酸、延胡索酸在萎凋全程先降后升，而苹果酸萎凋全程先升后降。由于试验条件限制，在工艺试验中取样时间有限，有机酸含量变化表现出的规律有限，未来可做进一步研究。