培养组学在人体肠道微生物研究中的应用

姚彩青，鄂晶晶，王俊国

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室 呼和浩特 010018）

人体肠道复杂的微生物环境对于维持机体健康具有重要作用，采用多组学技术研究人类肠道微生物区系以及微生物与宿主相互作用的机制已成为趋势[1]。其中宏基因组学以通量高，方法成熟且能快速得到样品微生物组成而被广泛应用。在基于宏基因组测序的研究过程中发现接近80%的细菌是未被培养的，且此方法具有严格的检测阈值，只能检测到每克样品中含量≥106的微生物，漏检了临床上一些重要的潜在致病菌[2-3]。例如：与胃肠疾病密切相关的产毒素大肠杆菌以及腹泻病例中的弯曲杆菌和沙门氏菌，存在因含量低而检测不到的问题[4-5]。纯培养方法作为最早应用于微生物研究的手段，具有较低的检测阈值，同时让更多之前被认为是不可培养的微生物得以培养，截至2018年，采用多种培养方法从人体分离得到的细菌已达2 776 种，其中很大一部分来自人体肠道[6]。纯培养方法在解析肠道微生物区系方面带来的巨大贡献，使这一技术被重新应用起来。

起初微生物学家依靠培养来研究定居在人体肠道内的微生物，发现同一样品显微计数得到的微生物数量远高于平板上培养的数量，证明样品中存在大量未培养的微生物[7]。宏基因组测序能够快速了解人体肠道微生物组成以及微生物与不同生理状态宿主的潜在联系，然而，只有培养得到特定的细菌，才能明确细菌在维持宿主健康或者导致患病所发挥的作用。同时，经培养得到的菌种可以确定作为活体对宿主产生影响，而分子手段不能区分菌种的死活，容易出现误以为死菌起作用的假阳性结果[3，8]。由多种培养条件与细菌的快速鉴定相结合的培养组学在全面描述人类肠道微生物区系中发挥了重要作用，在一定程度上填补了宏基因组测序技术的空白[9-10]。研究表明：非培养的宏基因组学与培养组学仅有15%检测到的菌种是相同的，两种技术在方法学上的差异为研究人员解析肠道微生态的可培养菌群与总体菌群多样性之间的差异带来挑战。表1列出两种方法的差别。本文结合最新研究成果，重点介绍培养组学及其在人体肠道微生物研究中的应用，同时探索培养组学今后的研究重点。

表1 非培养宏基因组学与培养组学在解析人类肠道微生物区系的差异Table 1 Differences between culture-independent metagenomic methods and culture-based methods in the analysis of human intestinal microbiota

1 培养组学

1.1 培养组学概述

培养组学也被称作高通量的细菌分离培养，是采用多种培养方式，同时结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS） 和16S rRNA 基因测序技术分离鉴定细菌的方法，目的是尽可能多的从样品中获得不同微生物，尤其是一些难培养的细菌[16]。培养组学最先是由环境微生物学家和临床微生物学家所提出并应用，之后应用到研究人体肠道微生物[17-18]。多种培养方法的使用使得在不到5年的时间里从肠道中分离出531种先前从未培养的微生物，其中包括数百种新细菌，总的菌种数量较之前翻了一倍[19]。法国Lagier教授团队在培养组学研究上取得了很大成就，2012年该团队采用212 种培养方法对两名非洲人和一名肥胖欧洲人的粪便进行培养，并结合质谱和16S rRNA 基因测序技术对获得的32 500 个单菌落进行鉴定，获得了174 种在人体肠道首次培养的细菌包括31 个潜在新种。研究中所使用的培养方法类型丰富，从212 种方法中确定出70 种有效方法，可以培养出全部的细菌，其中20 种可以培养到73%的细菌[3]。此研究不仅首次培养出许多肠道中难培养的细菌，同时对于培养方法的摸索为今后研究中减少方法的数量做出巨大贡献。2014年该团队从20 个方法中选择出18 个最佳方法，有效减少了培养工作量，并在2016年用于37 份粪便样品的培养，其中63 种首次被培养细菌、58 种非肠道细菌、65 种非人类细菌和89 种未知细菌得以培养[16，19]。2016年加拿大Lau 等[1]采用33 种培养基分厌氧、非厌氧共66 种培养条件对5份新鲜粪便样品进行分离，同时采用分子技术对样品16S rRNA 基因V3 区扩增测序，结合两种方法共鉴定到粪便中含量大于0.1%的全部微生物的95%，且培养方式鉴定到大多数的细菌，总共分离到79 个菌种纯培养物，包括12 个人类微生物组计划（Human microbiome project’s，HMP）最想获得的菌种。

非培养的宏基因组测序方法在研究肠道微生物区系的贡献不可忽视，近些年培养组学的优势也十分突出，结合两种方法深入研究人体肠道菌群多样性将是未来的研究趋势。分子测序结果可指导用于恢复难培养菌株的培养基设计，同时通过分析健康与疾病宿主微生物的差异可以明确哪些菌株值得培养[20]。而经培养获得的纯培养物更利于单菌株特殊基因功能的发掘，同时补充了基因组数据库，为通过宏基因组测序鉴定微生物提供方便。丹麦Rettedal 等[21]以培养肠道低丰度细菌为出发点，在培养基中加入不同类型抗生素用于选择培养一些难培养的微生物，进而对获得的单菌株进行耐药表型分析，成功确定了人类肠道微生物区系中16 种抗生素耐药表型的分类。微生物表型研究不仅包括菌株耐药性，还包括对胆盐，高或低pH 值等的耐受性，这些表型指标在获得菌株纯培养物后很容易测得，且表型数据是细菌能否作为益生菌所必须筛查的。培养组学的应用加快了具有潜在健康益处的新菌种的获得，在一定程度上促进了新型益生菌补充剂的开发利用。

1.2 不同策略用于难培养细菌的培养

由多种培养方法与细菌的快速鉴定相结合的培养组学最重要的就是培养方法的设计，合适的培养策略决定获得难培养微生物的数量。起初肠道中未被培养出来的这些微生物被称作不可培养微生物，直到纯培养技术被重新启用才逐渐将其称作难培养。所有难培养的微生物只要得到适合自身的培养方法都可以被培养[2]。营养物质、环境、温度和培养时间的选择是培养条件中最基础的点，此外培养策略的确定一方面基于基因组学分析的结果，依据对菌株代谢特性的预测，找到抑制或者适合菌株生长的添加物。另一方面，保证收集到的样品能快速被培养，人体肠道中厌氧菌丰富，一些严格厌氧菌暴露在空气中太久就会因接触氧气而失活，不利于后续的分离培养[22]。

传统商业化的非选择性培养基营养丰富，往往将样品中生存能力强且含量较高的菌群培养出来，而研究目的是培养肠道中含量低于106未被宏基因组学检测到的“暗物质”，故需要通过不同培养方式或在培养基中添加特定成分确保达到选择性培养的目的，也被称为 “杀死赢家策略”[9]。Rettedal 等[21]在加入环丙沙星、磺胺甲恶唑和红霉素等不同抗生素组合的平板上分离到了HMP 最想获得的12 种微生物，并结合表型数据，进一步明确哪种抗生素组合对应分离得到哪种类型的微生物，此研究不仅为低丰度物种的培养提供了借鉴思路，同时明确了不同抗生素用于肠道细菌培养可获得的具体菌种。临床微生物学家发现胆汁提取物、伊红、亚甲基蓝、柠檬酸钠和硫代硫酸钠等物质同抗生素一样也有助于较低丰度肠道细菌的分离[23]。Lagier 团队采用直径为0.2～5 μm 不等的无菌滤膜过滤样品中的主要菌群，通过在培养基加入大肠杆菌的特异性噬菌体T1 和T4 降低粪便中易培养的大肠杆菌含量，这两种方法的使用极大的提高了低丰度细菌的首次培养[16]。另一些技术包括对样品不断的稀释来培养少数菌群，也称为“稀释到灭绝”技术，或使用寡营养培养基，在一定程度上也能阻止优势菌群的生长[24-25]。以上所用方法均是为了培养肠道中丰度较低或者在存活竞争中处于劣势的菌群，这些条件的使用有效避免了与传统商业培养基培养出的相同菌群，加快了肠道中一些低丰度新菌种的分离。

血培养瓶预培养是培养难培养微生物的另一个重要手段，通过此方法分离的新菌种达56%[19]。预培养可以将样品中一些不易存活的菌种给予适宜条件使之生长起来再进行分离。Lagier 等[10，26]在将样品接种到不同的琼脂培养基之前，将粪便预先在有氧及厌氧血培养瓶中预培养1，5，10，14，21，26，30 d，采用此方法培养获得了50 种新细菌。培养肠道细菌常用的是在培养基中加入绵羊血，还可依据样品特点加入不同生长因子。研究人员在培养环境微生物时尽量让培养条件接近自然环境，分离发酵乳中的乳酸菌时会在培养基中加入无菌酸马奶上清液，目的也是为了更接近细菌的原始生存环境[27]。故为了模拟肠道环境，在培养基中加入经0.2 μm 无菌滤膜过滤后的粪便上清，促进了肠道中古细菌和厌氧菌的生长，Goodman等[11]通过此方法极大提高了培养粪便样品中细菌的效率。此外，还可在培养基中加入无菌瘤胃液、动物组织液、脂类物质和抗坏血酸或者是几种促生长物质的混合物，这些方法实现了许多难培养微生物的体外培养[16]。研究表明，添加瘤胃液可分离的新菌种占40%，添加绵羊血可分离的新菌种占25%，加上血培养瓶预培养的方法被认为是3个分离新细菌所必须的策略[19]。培养方法复杂多样，且数量过多，严重限制了培养组学的发展，研究者需要不断对培养方法进行归类以减少数量，在培养肠道细菌时可以按照营养丰富、寡营养、特殊营养以及不同菌种对不同物质的耐受性（酸、盐、乙醇和热等）几大类型来设计培养条件，最终使培养组学更易操作，更加高效。

1.3 MALDI-TOF MS 用于微生物鉴定

最初微生物鉴定采用表型鉴定的方法，虽然鉴定结果准确，但操作繁琐，所花费的时间较长，需要耗费大量的人力、物力。随着测序技术的发展，16S rRNA 基因扩增和测序成为细菌鉴定的黄金标准，特别是在没有光谱的情况下[28]。然而采用分子手段鉴定细菌至少需要24 h，这种方法既耗时又昂贵，限制了它在高通量培养组学中的应用。MALDI-TOF MS 在1980年发展起来，通过将细菌特定的蛋白质质谱与参考库进行比对，进而确定菌株所属的种属，近年来这种依靠细菌本身特定生物标记物来识别细菌逐渐成为鉴定的方法之一[29-30]。除了有较高的准确性外，它最大的优点是能够在很短时间内完成细菌鉴定，具有操作简便、鉴定迅速、准确率高和成本低的特点，尤其在价格上比16S rRNA 基因鉴定便宜100 倍。培养组学得以迅速发展很大原因基于MALDI-TOF 质谱技术的支持。2009年，研究表明MALDI-TOF 质谱鉴定细菌的正确率为95.4%，其中有84.1%可以鉴定到种水平，11.3%可以鉴定到属水平[31]。该质谱鉴定方法有效节省了时间和成本，鉴定结果的重复性较好，使得MALDI-TOF 质谱成为培养组学中细菌鉴定的有效方法。如果没有快速鉴定细菌的技术，培养组学获得成千上万菌落的鉴定，对于时间、成本和人工都是巨大考验，这一突破使设计复杂培养方法、探索人类肠道微生态系统成为可能[32]。

2 培养组学在人体肠道微生物研究中的应用

2.1 可培养细菌数据库的增加

近10年，随着宏基因组学在微生物研究中的应用，人类对肠道微生物区系的认识似乎已经到了平台期，随着培养组学的发展，肠道中的一些“暗物质”逐渐被揭开。一些通过分子手段鉴定不到的“Unclassified”逐渐被培养鉴定，不断有新培养得到的细菌基因组数据被收入人类肠道细菌数据库。据统计，截至2018年，通过培养方式首次分离得到的菌种已经由2015年统计的2 172 种增加到2 776 种，所增加的604 种细菌中，有372 种分离自肠道[6，33]。Lagier 等[3]在2012年首次采用培养组学分离鉴定到174 个以前在人类肠道中从未培养过的细菌，并对其中31 个新细菌的基因组测序，产生了约1 万个新的未知基因，这不仅扩充了细菌数据库，同时有助于细菌基因功能的深入发掘。该团队从2012年到2015年共发现新种121种，其中有91 种是通过培养得到，占比达75%。假设细菌与最接近它的标准菌株的相似性小于98.65%则被定义为疑似新种，那么使用培养方法每周就能确定1～25 个疑似新种[16，32]。到2017年，该团队共从人体中分离培养出329 个新细菌，使已知的人类细菌库增加了29%，且首次从人体内分离到4 种古生菌，其中包括2 个新菌种。通过培养组学增加人类微生物资源库，有助于研究人员从发现的新细菌中开发安全有效的适用于人体的益生菌[34]。人体肠道细菌参考基因组对于分析细菌基因功能十分重要，华大基因Zou 等[35]收集了来自健康人粪便中分离出的6 000 多个细菌中产生的基因组数据，并将其命名为可培养基因组参考集（Culturable genome reference），这是一个由1 520 个非冗余的、高质量的基因组草图组成的集合，覆盖人类肠道所有主要细菌门和属，其中还包括了264 个现有参考基因组目录中没有的基因组。可培养参考基因组数量的增加很大程度依赖于高通量的微生物培养，增加的数量越多使测序获得的基因序列与数据库比对的速度越快，同时也提高了对人体肠道微生物基因组的分辨率，进而能更加准确剖析单个菌株的基因功能。可培养基因组参考集的建立，极大的推动了基因组学在肠道微生物中的应用。

2.2 与人体肠道细菌疗法相关菌群的培养

结合宏基因组分析结果，目前发现的一些可能涉及到定植、急性或慢性感染的微生物被培养的比例很低[34]。虽然测序能认识到复杂的肠道微生态，却不能明确微生物在宿主中发挥作用的机制，也无法拿到单菌株做验证试验。培养组学通过培养健康与患病个体肠道中的差异生物标志物，获得细菌活体样本，进而深入剖析细菌与疾病之间的内在联系机制[32]。

肠道微生物区系的一个主要功能是提供抗定殖能力，其中病原体细菌被抑制或控制在感染水平以下。粪菌移植（FMT）已被广泛用于治疗由于致病或条件致病微生物过多而引起的胃肠道疾病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎等[36-37]。这得益于脑肠轴的发现，FMT 还被证实可以有效缓解自闭症[38]。而目前此方法仍存在很多问题，粪便捐献者在捐赠粪便过程中可能将自身一些潜在致病菌传染给被移植者，这是治疗中很难避免的问题。一些肠道细菌与结直肠癌或肥胖相关[39-40]，据报道，FMT 治疗后患者体重指数无故增加了8.5 个点[41]。人们希望确切地知道在治疗过程中具体有哪些细菌被转移给了患者。通过培养组学可以获得健康人与患者肠道的关键差异细菌群，服用混合菌的方式有效避免了患者受捐赠者带来的潜在致病菌的影响。艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile）是由于患者在服用抗生素后，导致肠道菌群严重失调，进而引发从轻度腹泻到伪膜性结肠炎的肠道疾病，该病具有高发病率、高致死率，老年人易患此类疾病。目前比较有效的治疗方式是通过FMT 来抑制肠道中艰难梭状芽孢杆菌的生长[42-43]，Amrane 等[44]通过对粪便捐赠者与艰难梭状芽孢杆菌感染者的粪便进行培养，得到了3 株已经被证明可以有效抑制艰难梭状芽孢杆菌感染的细菌。Ghimire 等[45]通过培养组学分离得到102 种细菌，采用共培养法筛选出66 种对艰难梭状芽孢杆菌有抑制作用的菌株，并依据表型数据（生长速率，短链脂肪酸的产生，甘露醇、山梨醇或琥珀酸的利用） 选取66 种细菌中的部分菌株组成256 种组合，用以评估对艰难梭状芽孢杆菌的抑制效果，发现菌种组成和比例对抑制效果都有影响，必须深入研究混合物中细菌之间以及其与宿主之间的相互作用，才能研制出有效抑制艰难梭状芽孢杆菌的细菌混合制剂。无论是研究细菌表型还是获得不同细菌的混合物都依赖于培养，此外培养物还可提供用于体外实验的菌株，并通过动物模型确认特定细菌在疾病发病机制中的作用。总之，加快培养肠道中难培养的细菌，积极开展临床治疗试验，是细菌疗法治愈与人体肠道微生物相关疾病的关键。

3 结语与展望

培养组学的研究主要是基于培养方法的摸索，虽然菌落的鉴定已经有MALDI-TOF 质谱技术助力，但复杂策略培养得到的大量菌落的选取仍带来很大工作量，与宏基因组测序技术相比，此研究确实是既耗费人工又耗费金钱的一项工作，但它仍是值得的。对于探明人体肠道微生物区系，明确疾病与肠道菌群的内在关系，以及新型益生菌的开发都具有重要作用，培养组学是未来肠道微生物研究的发展方向。