鱼肌球蛋白与腥味物质的结合作用研究

徐永霞，王 瑞，尹一鸣，赵洪雷，李学鹏，仪淑敏，王明丽，周小敏，励建荣*

（1渤海大学食品科学与工程学院 国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013 2蓬莱京鲁渔业有限公司 山东烟台 265600 3浙江兴业集团有限公司 浙江舟山 316120）

我国淡水鱼资源丰富，其中白鲢鱼、鳙鱼等低值淡水鱼产量高，价格低，且具有良好的凝胶性能，是生产鱼糜及鱼糜制品的良好原料[1-2]。然而，淡水鱼固有的腥味较重，在加工过程中难以脱除，严重制约了我国淡水鱼鱼糜加工产业的发展[3]。引起淡水产生鱼腥味的物质种类多样，组成复杂，主要包括醛酮类、醇类、含氮含硫类、烃类及萜烯衍生物等[4-5]。在淡水鱼加工及贮藏过程中，微生物和酶的作用以及脂肪的氧化是鱼腥味产生的重要原因。

鱼肉中的腥味物质大部分与蛋白基质结合而难以有效脱除[1]，其中肌原纤维蛋白、肌球蛋白作为鱼糜的主要组成成分，也是鱼糜中腥味物质的主要结合受体，直接影响最终产品的质地、保水性和风味等。目前关于蛋白质与风味物质相互作用的研究主要集中在大豆蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白和牛血清蛋白等蛋白上，而关于肉类蛋白尤其是鱼肉蛋白与风味物质相互作用的研究较少。刘璘等[1]利用顶空-固相微萃取-气质联用技术研究了白鲢鱼肉蛋白质与典型腥味物质的结合作用，Damodaran 等[6]研究了鱼肉中的肌动球蛋白对醛酮类风味物质的结合作用，Cao 等[7]研究了双氧水处理后草鱼肌动蛋白结构变化及对醛醇类风味物质吸附能力的影响。研究者大多采用色谱、光谱、核磁共振及分子模拟等方法研究小分子气味物质与蛋白质相互作用的机理，获得作用力类型、结合常数和结合位点等信息[8-9]。其中作为研究模型的β-乳球蛋白与醛、酮、醇类等风味化合物的结合位点主要分布在蛋白质的疏水区域，并且存在多个不同的结合位点，且这些作用位点对不同结构风味化合物的结合具有选择性[10]。不同类型和结构的蛋白质对于风味化合物的作用效应各有不同，关于鱼肉蛋白与风味物质相互作用的研究目前还较少。

鉴于此，本文以花鲢鱼为研究对象，选取鱼肉中6 种典型腥味化合物【己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇】，建立鱼肌球蛋白-腥味化合物作用模型体系，通过顶空-气相色谱/质谱法、差示扫描量热法、拉曼光谱及分子模拟等技术，分析鱼肌球蛋白与腥味物质的结合作用特征，旨在为淡水鱼蛋白产品中腥味物质的调控及风味品质改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜花鲢鱼（Aristichthys nobilis），锦州市林西街水产市场，平均尾重（1 500±50）g。

己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇均为色谱纯级，美国Sigma 公司：腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钾、氯化镁、乙酸镁、马来酸、β-巯基乙醇、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、碳酸氢钾等均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；LabRAM HR Evolution 拉曼光谱仪，崛场（中国）贸易有限公司；NanoBrook 粒度仪，美国布鲁克海文仪器公司；970CRT 荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Q2000 差示扫描热量仪，美国TA 仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 肌球蛋白的提取及成分分析 新鲜花鲢鱼宰杀后取背部肌肉，参照Park 等[11]的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白浓度采用双缩脲法测定，用牛血清蛋白做标准曲线。

参照Qi 等[12]的方法，利用十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对肌球蛋白组成进行分析，采用Quantity One 软件对胶进行扫描与分析。

1.3.2 腥味物质储备液的制备 将己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇分别溶于20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（含0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）中，超声2 min，制得最终质量浓度为2 000 mg/L 的腥味物质储备液，密封后于4 ℃下储存备用。

1.3.3 肌球蛋白-腥味化合物作用体系的构建采用Tris-HCl 缓冲液（含0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）将肌球蛋白溶液稀释至5 mg/mL，取10 mL 蛋白溶液置于顶空瓶中，分别加入上述腥味物质储备液，使最终蛋白样品溶液中腥味物质的质量浓度为1 mg/L，立即用PTFE 硅胶隔垫瓶盖密封，高速振荡混匀1 min 后，在30 ℃避光条件下恒温振荡1 h。以不添加任何腥味物质储备液的蛋白溶液为对照组。

1.3.4 肌球蛋白对腥味化合物结合能力的测定参考Wang 等[13]的方法，并稍加修改。采用顶空-气相色谱-质谱法（HS-GC-MS）测定振荡平衡后试样中各风味化合物的浓度，空白组以含相同浓度挥发物的缓冲溶液代替。上述振荡后的样品，置于气相自动进样托盘上。样品进样前在40 ℃下孵化10 min，然后通过顶空进样的方式吸取1 mL 样品空气插入GC 进样口，250 ℃下解吸5 min，不分流进样。

GC 条件：HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为99.999%高纯氦气，流速1.0 mL/min；柱箱初温40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速率升温至120 ℃，保持5 min。MS 条件：色谱-质谱传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；离子化方式：EI；电子能量70 eV；质量扫描范围30～550 m/z。

肌球蛋白对腥味化合物的结合能力用空白缓冲液组进样瓶中顶部空间风味物质的含量与蛋白质存在情况下其含量变化的百分比表示，见式（1）。

1.3.5 表面疏水性的测定 参照Chelh 等[14]的方法，采用ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）荧光探针法进行测定。用20 mmol/L PBS 缓冲液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0） 将肌球蛋白样品梯度稀释至0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，向4 mL 蛋白样品中加入50 μL 8 mmol/L ANS（用20 mmol/L pH 7.0 的PBS 缓冲液配制）后混合均匀，避光反应10 min，使用荧光分光光度计测定其荧光强度。以相对荧光强度对肌球蛋白浓度作图，曲线初始阶段的斜率即为肌球蛋白的表面疏水性指数。

1.3.6 Zeta 电位的测定 参照Beliciu 等[15]的方法，并稍加修改。采用Brookhaven 90 Plus 纳米粒度分析仪进行Zeta 电位的测定，将蛋白样品用20 mmol/L 的PBS（含0.6 KCl，pH 7.0） 稀释至0.05 mg/mL，测试前超声1 min 去除气泡。设定参数：采用35 mW 固态激光器，“高精度” 模式，波长660 nm，溶剂为水，测定温度25 ℃。

1.3.7 总巯基和活性巯基含量的测定 参照李颖畅等[16]的方法进行总巯基和活性巯基含量的测定，计算方法见式（2）。

式中，ε——巯基摩尔消光系数，此处为13 600 L/（mol·cm）。

1.3.8 拉曼光谱分析 参照Alix 等[17]的方法，采用高分辨率拉曼光谱仪，以氩离子激光器为光源对冷冻干燥后的蛋白样品进行测定。设定参数：激发波长532 nm，狭缝200 μm，功率120 mW，曝光时间60 s，扫描范围400～3 600 cm-1。以苯丙氨酸（1 003 cm-1）为内标进行归一化。

1.3.9 热稳定性分析 称取5～10 mg 冷冻干燥后的肌球蛋白样品于铝盒中，利用差示扫描量热仪进行热稳定性测定。参数设定：初始温度20 ℃，升温速率5 ℃/min，结束温度80 ℃。

1.3.10 分子静态动力学模拟 从UniProtKB 数据库检索到花鲢鱼肌球蛋白的氨基酸序列（https：//www.uniprot.org/）（PDB ID：E9JM97），利用SWISSMODEL server 进行同源建模，筛选不同的结果，通过观察模型蛋白氨基酸序列对源蛋白氨基酸序列的覆盖率及其拉试图的合理区域，选取覆盖率超过70%、拉试图合理区域超过90%的蛋白模型，获得的同源性蛋白模型被导入到Discovery Studio（DS，版本2.1，NeoTrident Technology LTD）中，通过最小化协议进行优化。

小分子配体：在DS 中建立己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇的三维模型，使用Minimization 协议对其进行优化。受体蛋白：除去受体蛋白的水分子和杂原子，并添加氢原子和Charmn 力场。使用DS/CDOCKER 方案对受体与配体进行对接。

1.3.11 数据分析 运用SPSS 23.0 软件进行方差分析（ANOVA）和Duncan 检验，使用Origin 9.0软件绘图，GC-MS 数据处理利用NIST11/Wiley7.0标准质谱库进行鉴定。数据后的肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 肌球蛋白SDS-PAGE 分析

肌球蛋白在高温、高压等强变性条件下会降解成6 条多肽链，包括2 条重链和4 条轻链，重链分子质量约为200 ku，轻链分子质量约为20 ku，另外2 条轻链约为15 ku 和25 ku[18]。花鲢鱼肌球蛋白的SDS-PAGE 凝胶电泳结果如图1所示。由图可知，本试验中提取的花鲢鱼肌球蛋白主要包含1 条肌球蛋白重链（分子质量约200 ku）和2 条肌球蛋白轻链（分子质量约为18 ku 和25 ku）。此外还有少量的肌动蛋白，分子质量约为43 ku。

图1 肌球蛋白电泳图Fig.1 The SDS-PAGE patterns of myosin

2.2 结合能力分析

食品中的蛋白质除了通过降解形成风味物质外，还可以通过分子键与风味物质相结合进而改变食品中风味组分的存在状态[19]。蛋白质与挥发性风味小分子之间的作用主要取决于蛋白质一级结构的多样性，同时也受高级结构的影响；此外，风味物质的种类、疏水性及分配系数对两者的结合作用也有直接影响[20]。不同腥味化合物与鱼肉肌球蛋白的结合能力如图2所示。1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、（E）-2-庚烯醛、辛醛和壬醛与肌球蛋白的结合能力分别为20.82%，21.4%，23.59%，25.29%，26.86%和28.25%，由此发现随着风味化合物碳链长度、不饱和度以及官能团的改变，结合能力也随之改变。随着直链醛碳链长度及不饱和度的增加，结合能力逐渐增大（P<0.05），这可能是由于随着风味化合物碳链的增长和不饱和度的增加，疏水性逐渐增强，从而拥有更多的结合位点，同时也说明两者之间的作用力可能为疏水相互作用[20]。此外，醛类中的不饱和双键可能会和蛋白组成中的赖氨酸、组氨酸残基发生加成反应，从而增强其结合能力[21]。醇类物质由于极性较强，与蛋白质之间的疏水相互作用相对较弱，因此结合能力较低。Kühn 等[21]提出，大部分挥发性物质在自然状态下都具有疏水性，某些特定基团，如羰基的存在对蛋白与风味化合物之间的相互作用具有显著影响，其中醛类化合物与蛋白质的作用能力要高于酮类和醇类化合物。Tan 等[22]通过数学模型发现风味化合物与蛋白质之间的作用能力主要受碳原子数、氢原子数、链长及沸点大小等的影响。Brewer 和Vega[23]研究表明，疏水相互作用及氢键是影响蛋白质与挥发性风味物质吸附能力的主要作用，蛋白结构的展开也会提供更多的吸附位点。

2.3 表面疏水性的变化

表面疏水性可以有效地反映蛋白表面与外界极性水环境接触的疏水性氨基酸的相对含量，常被用来评价蛋白质的变性程度[7]。如图3所示，对照组的表面疏水性最低，添加不同种类的腥味化合物均使肌球蛋白的表面疏水性显著增加（P<0.05）。这是由于醛醇类腥味化合物的存在导致肌球蛋白发生变性，使其结构展开，暴露出更多的脂肪族及芳香族氨基酸侧链等疏水性基团，从而导致肌球蛋白表面疏水性的增加，并且风味化合物结构不同产生的影响具有显著差异。此外，随着醛类化合物碳链长度的增加，肌球蛋白的变性程度也逐渐增加（P<0.05）。相比于饱和醛庚醛，不饱和醛（E）-2-庚烯醛使肌球蛋白的表面疏水性有所增加，然而无显著性差异（P>0.05）。由此可见，相对于不饱和键，风味化合物的碳链长度对肌球蛋白的溶解度有着更大的影响。此外，1-辛烯-3-醇对肌球蛋白表面疏水性的影响要显著低于醛类物质（P<0.05）。由此可见，与链长及不饱和度相比，风味化合物官能团的变化对蛋白质与风味化合物之间的相互作用影响更大。

图3 肌球蛋白与腥味化合物结合后表面疏水性的变化Fig.3 Changes in surface hydrophobicity of myosin binding of fishy odor compounds

2.4 Zeta 电位分析

蛋白质双螺旋结构的侧链上含有多种类型的极性基团（如羟基、羧基及氨基），天然结构中亲水性极性基团会暴露在外部水环境中，使得蛋白质表面带有一定数量的电荷，这些基团所带电荷的多少以及电荷的正负性将直接影响蛋白质溶液的Zeta 电位值，当溶液体系中的Zeta 电位绝对值降低时，表明蛋白质表面所带电荷减少，亲水性基团被包埋，暴露出更多的疏水性基团，蛋白构象发生改变[24]。添加不同种类腥味化合物后，鱼肌球蛋白溶液的Zeta 电位绝对值变化情况如图4所示。由图可知，腥味化合物的存在使肌球蛋白的Zeta 电位绝对值降低，除1-辛烯-3-醇外，己醛、庚醛等醛类化合物使肌球蛋白的Zeta 电位值显著降低（P<0.05），其中对照组、添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛肌球蛋白组的Zeta 电位绝对值分别为26.36，24.48，22.05，16.95，13.93，10.47，12.15 mW。可以看出，风味化合物碳链长度及不饱和度的增加会使蛋白质的变性程度增加，从而使蛋白样液的Zeta 电位绝对值逐渐降低，并且醇类物质的影响相对较小，这与前面蛋白表面疏水性的变化结果相一致。

图4 肌球蛋白与腥味化合物结合后Zeta 电位的变化Fig.4 Changes in zeta potential of myosin binding of fishy odor compounds

2.5 总巯基及活性巯基的变化

巯基（-SH）是蛋白质结构中最具反应活性的基团之一，其含量变化直接影响蛋白结构的稳定性。总巯基主要包括活性巯基和包埋在蛋白内部的巯基，SH1、SH2和SHa 是肌球蛋白分子中巯基的主要类型，其中SH1、SH2主要存在于肌球蛋白的头部区域，当蛋白构象发生改变时，埋藏在蛋白内部的巯基会暴露出来，因此巯基含量的变化是衡量蛋白质变性程度的重要指标[25]。肌球蛋白与腥味化合物结合后巯基含量的变化如图5所示，醛醇类物质的存在使肌球蛋白的总巯基和活性巯基含量显著升高（P<0.05）。与对照组相比，添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛后肌球蛋白总巯基含量分别增加了2.17，4.39，5.47，8.23，12.48，6.61 mol/105mg。这是由于风味化合物的存在使肌球蛋白发生变性，蛋白结构展开，导致更多的巯基暴露在蛋白表面，从而使得总巯基和活性巯基的含量都呈上升趋势，并且随着化合物碳链长度及不饱和度的增加，影响更加显著。此外，醛类化合物对肌球蛋白巯基含量的影响要显著高于醇类化合物，这一结果与前面肌球蛋白表面疏水性的变化趋势一致。蛋白表面疏水性增加的同时，会伴随着巯基含量的增加以及表面电荷数的降低，从而导致蛋白自身稳定性降低。

图5 肌球蛋白与腥味化合物结合后巯基含量的变化Fig.5 Changes in sulfhydryl groups content of myosin binding of fishy odor compounds

2.6 拉曼光谱分析

拉曼光谱分析可以反映蛋白质肽链的骨架振动、氨基酸侧链周围微环境的变化[26]，其中蛋白质主链的构象及其二级结构的含量都与酰胺I 区（1 600～1 700 cm-1）的谱带信息有关[27]。蛋白质的二级结构包括α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、β-折叠（1 665～1 680 cm-1）、β-转角（1 680 cm-1附近）和无规则卷曲（1 660～1 665 cm-1），其中α-螺旋是蛋白质结构有序性的代表，β-转角等代表蛋白质的无序性和松散性[28]。鱼肌球蛋白与腥味化合物结合前、后的拉曼光谱图及二级结构相对含量的变化情况分别如图6和表1所示。由表可知，添加风味物质后，α-螺旋结构含量显著降低（P<0.05），β-折叠和β-转角结构含量显著上升（P<0.05），这可能是由于醛类和醇类物质的作用使肌球蛋白结构展开，使α-螺旋结构向β-折叠和β-转角转变。与对照组相比，添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛后α-螺旋含量分别下降了7.09%，10.75%，11.5%，13.54%，14.14%和12.34%。研究表明[27-28]，蛋白质高级结构的稳定性主要依靠疏水作用、氢键、二硫键、静电相互作用等维持，其中α-螺旋结构是稳定蛋白质构象最主要的结构，它主要决定于多肽链上羰基（C=O）和氨基（-NH）之间形成的氢键。添加腥味化合物可能使氢键破坏，α-螺旋解旋，导致蛋白质发生变性，并且化合物碳链长度的增加，碳碳双键的存在，会增加腥味化合物与肌球蛋白之间的结合作用，促使蛋白质结构从有序向无序转变，从而增大了蛋白质的变性程度。

图6 肌球蛋白与腥味化合物结合后的拉曼光谱图Fig.6 The Raman spectrum of myosin binding of fishy odor compounds

表1 肌球蛋白与腥味化合物结合后二级结构相对含量的变化Table 1 The relative content of secondary structures of myosin binding of fishy odor compounds

2.7 热稳定性分析

腥味化合物对鱼肌球蛋白热变性中点温度（Tm）及变性焓值（ΔH）的影响如表2所示。研究表明，蛋白质的热力学转变温度与其热稳定性有直接关系，Tm值越高，蛋白热稳定性越高，破坏其空间稳定性所需能量也就越高，ΔH 值越大[28]。由表2可知，与对照组相比，1-辛烯-3-醇使肌球蛋白的热变性温度略有降低，而醛类化合物使肌球蛋白的热变性温度显著降低（P<0.05），两类化合物均使肌球蛋白的焓变值显著降低（P<0.05），这是由于腥味化合物诱导肌球蛋白发生部分变性，使维持蛋白质稳定性的α-螺旋结构破坏，从而降低了蛋白质变性所需要的焓变值，导致其热稳定性降低，并且随着化合物碳链长度的增加影响越显著。Wang 等[13]在探究豌豆蛋白与风味物质结合作用时也发现了类似的结果。

表2 肌球蛋白与腥味化合物结合热稳定性的变化Table 2 Changes of the thermal properties of myosin binding of fishy odor compounds

2.8 分子静态动力学模拟

同源建模获得的花鲢鱼肌球蛋白3D 模拟图如图7所示，通过DS 软件的CDOCKER 程序对蛋白受体与腥味化合物（配体）进行对接，结果如图8所示。从图8中可以看出，腥味化合物可以与蛋白上的Phe101，Ile104，Ile100，Leu116，Phe45 等氨基酸通过氢键结合，同时还以共价键的形式与Phe101，Lys166 等氨基酸结合。此外，与醇类物质相比，醛类物质还可以与蛋白上的Lys109 和Thr168 通过疏水相互作用结合，分子模拟的结果辅助验证了疏水性相互作用、氢键及共价键是花鲢鱼肌球蛋白与所选腥味化合物结合的主要方式。

图7 花鲢鱼肌球蛋白同源模拟3D 图Fig.7 3D homology modeling diagram of bighead carp myosin

图8 腥味化合物与花鲢鱼肌球蛋白对接结果3D 图Fig.8 3D docking diagram of fishy odor compounds binding to bighead carp myosin

3 结论

本试验通过HS-GC-MS、分子模拟结合光谱等技术探究了鱼肌球蛋白与6 种特征腥味化合物

之间的结合作用机制。结果表明，醛类物质与肌球蛋白之间的结合能力随着碳链长度及不饱和度的增加而显著增大，且1-辛烯-3-醇的结合能力显著低于醛类；所选的特征腥味物质与肌球蛋白之间的作用力主要是疏水相互作用、氢键和共价键；小分子腥味物质的存在使肌球蛋白结构展开，疏水性基团暴露，总巯基和活性巯基含量增加，蛋白质的热稳定性降低，并且醛类物质对肌球蛋白结构的影响显著高于醇类。