复合保鲜剂对阿根廷鱿鱼中生物胺的控制作用

李颖畅，张馨元，孙皓齐，曹娜娜，韩 笑，沈 琳，励建荣*

（1渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013 2大连东霖食品股份有限公司 辽宁大连 116101）

鱿鱼是我国重要的远洋捕捞经济鱼类，阿根廷鱿鱼（Illexargentinus）占据了不小的份额。鱿鱼中含有丰富的氨基酸、蛋白质，具有低脂肪、低热量等优点，深受人们的喜爱[1]。然而，阿根廷鱿鱼极易腐败变质，产生生物胺（Biogenic amine，BA），影响其营养价值，并造成一定的浪费。生物胺是一类具有生物活性的低分子质量的有机碱，主要由氨基酸的脱羧或者醛、酮的氨基化以及转氨作用形成[2]。微量生物胺是生物体内的正常活性成分，在生物代谢中起着重要作用，当人体摄入过量的生物胺（尤其是同时摄入多种生物胺）时，会引起诸如头痛、恶心、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命[3]。

ε-聚赖氨酸盐酸盐（ε-poly-L-lysine hydrochloride，ε-PLH）是一种天然的，具有良好抑菌效果的多肽聚合物，在高温下稳定，可经生物降解为赖氨酸[4]。郑玉秀等[5]发现ε-聚赖氨酸盐酸盐能显著延缓美国红鱼调理鱼片中微生物生长，延缓鱼片挥发性盐基氮（TVB-N）、硫代巴比妥酸（TBA）等保鲜指标变化，延长保质期。Jia 等[6]研究发现将ε-聚赖氨酸盐酸盐添加至鱼丸中可提高其安全性，且随ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度的增加，单增李斯特菌滞后时间延长，耐热性降低。百里香酚存在于多种植物中，具有百里草或麝香草的香味[7]，通过破坏微生物细胞膜，损坏酶系统，破坏遗传物质达到抑菌的作用[8]。蒋慧亮等[9]发现百里酚作用于大菱鲆中，对微生物的生长有明显抑制作用，延缓了大菱鲆的货架期。Yang 等[10]利用百里香酚、聚乳酸和聚己二酸丁二醇酯制成可降解活性膜，应用于三文鱼中，能显著减少三文鱼的菌落总数、生物胺含量等，延长3～4 d 的货架期。

目前对阿根廷鱿鱼的研究主要集中于其鲜度及甲醛控制方面，对其生物胺的控制还未见报道。本文研究了ε-聚赖氨酸盐酸盐、百里香酚及其复配物对阿根廷鱿鱼中生物胺的影响及品质控制，以期提高鱿鱼的品质，延长鱿鱼的货架期，为鱿鱼等水产品生物胺和品质控制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿根廷鱿鱼，锦州市林西水产市场；ε-聚赖氨酸盐酸盐，浙江新银象生物工程有限公司；百里香酚，上海麦克林生化科技有限公司；生物胺标准品：2-苯乙胺（2-Phenethylamine，2-Phe，≥99.5%）、酪胺（Tyramine，Tyr，≥99%）、丹磺酰氯（99%），美国Sigma 公司；腐胺（Putrescine，Put，≥99%）、尸胺（Cadaverine，Cad，≥97%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钠、氨水、丙酮、硫代巴比妥酸，国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为生物试剂或分析纯级试剂；乙腈、甲醇均为色谱纯级，美国Fisher Chomical 公司；平板计数琼脂（生化试剂），青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-2030 高效液相色谱、UV-2550 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；Multifuge X1R 冷冻高速离心机，美国Thermo 公司；PHSJ-3F 实验室pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；CR-400色彩色差计，柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；KQ5200E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q 超纯水系统，美国Millipore 公司；LRH-150 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 将阿根廷鱿鱼在-20 ℃下运送至实验室，随机分为4 份，其中3 份分别在0.05%ε-聚赖氨酸盐酸盐、0.05%百里香酚、复配保鲜剂（0.025%ε-聚赖氨酸盐酸盐+0.025%百里香酚）中浸泡30 min，另外一份在蒸馏水中浸泡30 min，作为对照组。将上述4 份鱿鱼样品分2 组，分别放入0 ℃冰箱中贮藏，每隔3 d 随机抽样进行各项指标的测定，共贮藏18 d。取样时除去头、皮和内脏，只取胴体肌肉，用于各指标和生物胺含量的测定。所有指标测定均取3 个平行样品。

1.3.2 生物胺测定 取10 g 鱼肉，加入20 mL 5%三氯乙酸，经均质机均质后超声提取30 min，4℃离心（8 000 r/min）15 min，移出上清液后残渣再用20 mL 5%三氯乙酸重复提取1 次，合并上清液，定容至50 mL，过滤。取0.3 mL 滤液，加入100 μL 饱和碳酸氢钠溶液和50 μL 2 mol/L 氢氧化钠，加入10 mg/mL 丹磺酰氯（Dns-Cl）衍生剂0.3 mL，振荡混匀，并置于60 ℃水浴30 min，冷却后加入100 μL 25%氨水，25 ℃下于暗处静置30 min。冷却后用乙腈定容至1.5 mL，用0.45 μm有机滤膜过滤，待测。

色谱条件：以超纯水和乙腈为流动相于C18柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C184.6 nm×250 nm，5 μm） 上按表1进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，DAD 检测波长为254 nm，进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

样品生物胺含量计算单种生物胺含量，见式（1）。

式中，X——样品中单组分生物胺含量（mg/kg）；C——由HPLC 法计算的进样液生物胺质量浓度（mg/L）；V——5%TCA 定容体积数（mL），在本研究中为50 mL；M——取样量（g）。

1.3.3 菌落总数测定 参考《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2-2016）[11]的测定方法进行稀释平板计数法测定。

1.3.4 TBA 测定 参考丁婷等[12]的方法。

1.3.5 pH 测定 参考 《食品安全国家标准食品pH 值的测定》（GB 5009.237-2016）[13]的测定方法。

1.3.6 感官评定 参考李颖畅等[14]的感官评分表，稍加修改，对阿根廷鱿鱼进行感官评定，由5人组成感官评定小组，分别对4 组样品的气味、黏液、肌肉弹性、色泽外观进行评级打分，各指标进行加权统计，权重分别是气味0.3，黏液0.2，肌肉弹性0.2，色泽外观0.3。各指标的分值区间总分为0～10 分，一级鲜度为8～10 分，二级鲜度为6～8分。

1.3.7 挥发性气味测定 称取5 g 搅碎的鱼肉置于烧杯中，用保鲜膜密封，静置30 min 后进样。采用顶空进样法测定挥发性物质，直接将进样针头插入含有鱼肉的密封塑料杯中。测定条件：样品准备时间5 s；传感器清洗时间105 s；进样流量300 mL/min；分析采样时间120 s。利用电子鼻自带Win Muster 软件对挥发性气味进行主成分分析（PCA）。

1.3.8 数据统计分析 试验数据处理及统计分析采用Origin 9.1 和SPSS 19.0，处理结果均以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 生物胺的变化

2.1.1 苯乙胺含量的变化 苯乙胺是一种芳香族生物胺，有助于人体正常的生理功能，然而人体若摄入过量的苯乙胺，则可能出现恶心、失眠、头晕和头痛等不良反应[15]。如图1所示，在贮藏的0～9 d 内，苯乙胺的含量都处于较低水平，苯乙胺变化趋势与闵娟等[16]研究的马鲛鱼与秋刀鱼中苯乙胺含量变化趋势类似。贮藏初期，阿根廷鱿鱼苯乙胺含量为6.55mg/kg，对照组和处理组的苯乙胺无明显增加，均处于较低水平，第12 天后鱿鱼中的苯乙胺含量开始迅速增加。在贮藏末期，对照组、ε-聚赖氨酸盐酸盐组、百里香酚组和复合保鲜剂组分别为11.15，8.32，8.71 mg/kg 和7.41 mg/kg，对照组显著（P＜0.05）高于3 个处理组，复合组的苯乙胺含量最低，说明使用复合保鲜剂进行浸泡的鱿鱼对苯乙胺的控制效果优于单种保鲜剂的使用。

图1 保鲜剂对阿根廷鱿鱼苯乙胺的影响Fig.1 Effect of preservative on phenethylamine of Illexargentinus

2.1.2 腐胺含量的变化 腐胺广泛存在于水产品中，具有非常强的毒性，过量会导致低血压、破伤风、心率过快、四肢痉挛，甚至有致癌的风险，是引起水产品劣变的主要生物胺[17]。由图2可知，贮藏初期腐胺含量为5.42 mg/kg，且0～9 d 内均保持在较低水平，与倪佳丹等[18]研究结果相一致。第12天开始腐胺含量明显增加，贮藏末期4 组腐胺含量分别为31.26，24.81，14.13 mg/kg 和11.69 mg/kg，且在整个贮藏期间百里香酚、ε-聚赖氨酸盐酸盐和复合保鲜组的阿根廷鱿鱼腐胺含量均低于对照组。表明百里香酚、ε-聚赖氨酸盐酸盐能显著控制腐胺的产生，且复合保鲜剂对其的控制作用优于单一使用百里香酚或者ε-聚赖氨酸盐酸盐（P<0.05）。

图2 保鲜剂处理对阿根廷鱿鱼腐胺的影响Fig.2 Effect of preservative on putrescine of Illexargentinus

2.1.3 尸胺含量的变化 尸胺是由赖氨酸在赖氨基酸脱羧酶的作用下进行脱羧反应而形成的一种脂肪族多胺类化合物[19]，与腐胺性质相似，也具有非常强的毒性，且腐胺和尸胺均能与亚硝酸反应生成亚硝酸盐等致癌物[20]。如图3所示，对照组和处理组的阿根廷鱿鱼在0～9 d 内腐胺含量均保持在较低水平，贮藏初期尸胺含量为5.27 mg/kg，12 d 后对照组和3 个处理组中尸胺含量增加，其中ε-聚赖氨酸盐酸盐、百里香酚和复合保鲜组尸胺的增长速度较对照组均显著（P＜0.05）降低，这说明ε-聚赖氨酸盐酸盐、百里香酚能显著控制尸胺的产生，且复合保鲜剂对尸胺的控制效果更佳。第18 天，复合保鲜剂组的腐胺含量为15.86 mg/kg，较对照组的48.59 mg/kg 降低了67.35%。说明ε-聚赖氨酸盐酸盐、百里香酚均能够明显控制尸胺的产生，且使用复合保鲜剂对尸胺的控制效果优于单一使用百里香酚或者ε-聚赖氨酸盐酸盐。

图3 保鲜剂处理对阿根廷鱿鱼尸胺的影响Fig.3 Effect of preservative on cadaverine of Illexargentinus

2.1.4 酪胺含量的变化 酪胺的前体物质是酪氨酸，摄入过多的酪胺会引起食物中毒，美国的食品药品监督局（Food and drug administration，FDA）规定酪氨酸含量不能超过100 mg/kg[21]。由图4可知，4 组阿根廷鱿鱼酪胺含量在前期均保持较低水平，初期酪胺含量为5.27 mg/kg，第12 天时对照组和处理组的酪胺含量开始大幅度增加，这可能由于微生物含量增多，氨基酸脱羧酶生成速度加快。在贮藏末期，对照组的酪胺含量为15.54 mg/kg，而复合保鲜剂组为8.70 mg/kg，相较于对照组处于较低水平，降低了43.66%，说明在整个贮藏期内复合保鲜剂能有效控制酪胺的产生。Krizek 等[22]研究发现用百里香酚精油处理鲤鱼鱼片，可有效抑制鲤鱼鱼片中酪胺的形成。本研究发现百里香酚也具有抑制鱿鱼中酪胺含量增加的作用，且ε-聚赖氨酸盐酸盐与百里香酚复合使用效果更好。

图4 保鲜剂对阿根廷鱿鱼酪胺的影响Fig.4 Effect of preservative on tyramine of Illexargentinus

2.2 菌落总数的变化

引起水产品腐败变质的主要因素有微生物、酶促作用和化学变化，而水产品的腐败程度可以通过腐败微生物的生长状况观察得出[23]，因此菌落总数（TVC）被示为衡量水产品质量的常规指标[24]，且水产品中生物胺的含量与其微生物数量有关[25]。阿根廷鱿鱼在不同保鲜剂处理下的微生物变化如图5所示。贮藏初期，初始菌落总数（TVC）为3.30 lg（CFU/g）。随着贮藏时间的延长，对照组、ε-聚赖氨酸盐酸盐组、百里香酚组和复合保鲜组的TVC 值均呈显著（P＜0.05）增加趋势，且各组间存在显著性差异（P<0.05）。Al-Dagal 等[26]认为TVC 不能超过6 lg（CFU/g），否则水产品将失去食用价值。对照组的阿根廷鱿鱼中微生物的生长速度最快，TVC 值在第18 天时达到了6.15 lg（CFU/g），而其于3 组处理的阿根廷鱿鱼在整个贮藏期菌落总数均未超标，其中使用复合保鲜剂处理的阿根廷鱿鱼的TVC 值最低，在第18 天为5.43 lg（CFU/g），说明ε-聚赖氨酸盐酸盐和百里香酚有显著的抗菌作用[27-28]。结果表明，保鲜剂的使用均能够有效地抑制阿根廷鱿鱼中微生物的生长，使用复合保鲜剂处理对微生物生长的抑制效果要优于使用单一使用百里香酚或者ε-聚赖氨酸盐酸盐剂处理。

图5 保鲜剂对阿根廷鱿鱼菌落总数的影响Fig.5 Effect of preservative on TVC of Illexargentinus

2.3 TBA 的变化

脂质氧化是水产品腐败的原因之一，硫代巴比妥酸（TBA）是反应水产品脂肪氧化程度的一个重要指标[29]。TBA 值越大，说明水产品的脂肪氧化程度越高。随着贮藏时间的延长，阿根廷鱿鱼所含的不饱和脂肪酸与氧气反应发生酸败，产生系列小分子物质，如醛、酮、酸等，最终散发不愉快气味，主要产物是丙二醛（MDA）。如图6所示，初始TBA 值为0.31 mg MDA/kg，贮藏期间，对照组和处理组的TBA 值均呈上升趋势，与谭明堂等[30]关于冰衣结合迷迭香酸处理鱿鱼的TBA 含量变化趋势一致。第18 天，使用ε-聚赖氨酸盐酸盐和百里香酚处理的阿根廷鱿鱼的TBA 值分别为0.90 mg MDA/kg 和0.83mg MDA/kg，复合保鲜剂处理组TBA 值为0.76 mg MDA/kg，而此时对照组的TBA 值为0.97mg MDA/kg。说明百里香酚组和复合保鲜剂组的TBA 值相对较低，这由于百里香酚是一种良好的抗氧化剂，可以有效抑制脂肪的氧化[31]。

图6 保鲜剂对阿根廷鱿鱼TBA 的影响Fig.6 Effect of preservative on TBA of Illexargentinus

2.4 pH 值的变化

pH 是通过表示水产品的酸碱程度，反映鱼体新鲜程度的指标。不同保鲜剂处理对阿根廷鱿鱼pH 值的影响见图7。pH 的初始值为6.72，随着贮藏时间的延长，对照组、ε-聚赖氨酸盐酸盐组、百里香酚组和复合保鲜组的阿根廷鱿鱼pH 值都略有降低，对照组的阿根廷鱿鱼在6 d 达到最低，后pH 值迅速上升，这与Sun 等[32]的结果相似。对照组和3 个处理组的阿根廷鱿鱼pH 值均在第6～9天降至最低，其下降的原因是鱿鱼死后僵硬，肌肉中的糖原在无氧条件下酵解为乳酸，同时，肌肉中的磷酸肌酸（Crp）在磷酸肌酸激酶的催化作用下将ADP 变为ATP 和肌酸，导致pH 值下降。第9～18 天，蛋白质在微生物和生物酶的作用下逐渐降解为氨和生物胺类等碱性腐败物质，致使pH 值上升。pH 值组间差异不显著（P＞0.05），复合保鲜剂的pH 值略低于对照组。说明保鲜剂处理的阿根廷鱿鱼能有效延缓乳酸的产生，延缓阿根廷鱿鱼蛋白质及氨基酸的分解产生部分氨类化合物，以及产生三甲胺等碱性物质，从而增加阿根廷鱿鱼的货架期。

图7 保鲜剂对阿根廷鱿鱼pH 值的影响Fig.7 Effect of preservative on pH value of Illexargentinus

2.5 感官评定分析

使用不同保鲜剂处理阿根廷鱿鱼得到的感官评分见图8。Li 等[33]认为感官评分值低于6 分的样品既不能食用，也不被消费者接受。贮藏初期的感官评分为9.7 分，属于新鲜状态，随着贮藏时间的延长，对照组阿根廷鱿鱼表面黏度增加迅速，肌肉弹性变差，腐败气味加剧。各处理组虽有一定程度的变化，但均优于对照组。对照组、百里香酚组、ε-聚赖氨酸盐酸组和复合保鲜剂组的阿根廷鱿鱼的感官评分均在第12 天达到二级鲜度临界值以下，分别为4.57，5.03，4.9，5.27 分，且使用复合保鲜剂处理的阿根廷鱿鱼感官评分的下跌速度低于对照组、ε-聚赖氨酸盐酸盐组和百里香酚组，这与生物胺含量变化趋势一致。这可能由于气味物质由腐败微生物代谢产生，保鲜剂能有效抑制微生物的生长，减少了异味、生物胺的产生。复合保鲜组阿根廷鱿鱼体表比对照组更加鲜亮，这因为ε-聚赖氨酸盐酸盐和百里香酚的复合使用阻止了阿根廷鱿鱼组织中的脂质过氧化，又较百里香酚组能够有效优化鱼体表面颜色，从而达到一个良好的控制效果。这些结果表明，使用复合保鲜剂处理结合冰温贮藏可以有效控制阿根廷鱿鱼感官的变化。

图8 保鲜剂对阿根廷鱿鱼感官评价的影响Fig.8 Effect of preservative on sensory evaluation of Illexargentinus

2.6 挥发性气味分析

电子鼻技术又被称为人工嗅觉技术，是一种模仿人类嗅觉的电子系统，是一种可以快速检测食物挥发性气味的方法，能够识别单一和复杂气味，从而达到对食品挥发性成分进行感知、分析及判别的一种检测技术[34]。陈东杰等[35]发现随着海鲈鱼贮藏时间的延长，电子鼻的响应值数值在海鲈鱼贮藏过程中增加，采用PCA、LDA 方法可较好区分不同贮藏时间下海鲈鱼的腐败程度。

保鲜剂处理的阿根廷鱿鱼鱼肉的主成分分析如图9所示。在相关性矩阵模式下，各处理组阿根廷鱿鱼的第1 主成分贡献率和第2 主成分贡献率之和，均大于90%，因此这2 个主成分已经基本代表了样品的主要信息特征。

图9 阿根廷鱿鱼电子鼻PCA 分析图Fig.9 PCA analysis chart of Illexargentinus electronic nose

电子鼻能较好的区分各组的阿根廷鱿鱼，随贮藏时间的变化有明显改变，各组在第6～9 天样品椭圆间距呈增大趋势，第9 天后椭圆间距减小，可能由于阿根廷鱿鱼在贮藏后期经微生物作用产生的生物胺，导致不愉快气味出现，以及各种有毒物质增加，电子鼻对这些物质有特定的的响应信号，导致椭圆间距减小。

百里香酚组和复合保鲜组阿根廷鱿鱼在PCA图中椭圆间距在后期变化较小，这可能是由于在这2 组内添加的百里香酚具有一定的芳香味物质，干扰了传感器对鱿鱼气味的识别，掩盖了鱿鱼本身因微生物作用产生的不愉快气味，贮藏后期较前期区分不够明显，产生一定影响。因此说明用PCA 分析法能够在一定程度上区分不同新鲜度的阿根廷鱿鱼，不同保鲜剂的选择可能会对检测结果产生一定影响。

3 结论

保鲜剂能够有效控制阿根廷鱿鱼中的4 种主要生物胺，ε-聚赖氨酸盐酸盐和百里香酚对苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺的产生均有一定的抑制效果，然而复合保鲜剂的效果优于单一使用百里香酚或者ε-聚赖氨酸盐酸盐。利用电子鼻的PCA 分析能够在一定程度上反应各组阿根廷鱿鱼的挥发性物质的变化，而百里香酚具有浓郁的芳香味，对挥发性成分物质等有一定的影响。复合保鲜剂的使用比单一使用百里香酚或者ε-聚赖氨酸盐酸盐可以更有效的降低TBA 和TVC，并且能够缓解鱼体生理生化反应，抑制蛋白质的分解，延缓pH值的上升，并且有较高的感官评分，比对照组延长了3 d 的货架期，保鲜效果最佳。