青砖毛茶对高脂饮食小鼠肠道微生物的影响

冯 琳，龚自明，刘盼盼，郑鹏程，郑 琳，王雪萍，高士伟，桂安辉

（湖北省农业科学院果树茶叶研究所 湖北省茶叶工程技术研究中心 武汉 430064）

青砖茶是我国特有的一种黑茶，主产于鄂南、湘北茶区，具有减肥、降脂，舒畅肠胃，抗氧化，降血糖等众多生理功能，是西北等高脂、高热饮食地区人民不可或缺的天然保健饮料[1-2]。青砖毛茶（老青茶）是加工青砖茶的原料，是决定青砖茶品质和健康功能的重要因子；其加工工艺与绿茶较为类似，通常以较为粗老的中、小叶种茶树鲜叶为原料，经杀青、揉捻、晒干等工艺加工而成[2]。众所周知，云南大叶种茶树鲜叶经杀青、揉捻、晒干制成的晒青毛茶（滇青），再将其蒸压制成普洱生茶，具有减肥、降脂、抗氧化等较多的生理、药理功能[3]。丛涛等[4]研究表明饲料中添加6%的普洱生茶，在不影响机体营养状况的条件下，能有效降低大鼠体重和甘油三酯水平；江新凤等[5]研究表明普洱生茶能显著调节实验性高脂血症大鼠机体的血脂水平，有效预防高脂血症，起到抗氧化等功能；郭刚军等[6]研究认为云南晒青毛茶提取物对DPPH 自由基、羟基自由基与超氧阴离子有较强的清除能力，具有较强的抗氧化活性。然而，目前关于加工工艺与普洱生茶类似的青砖毛茶的减肥、降脂、抗氧化等健康功能相关研究报道较少。

肠道菌群被认为是肥胖、血脂异常和脂肪肝等代谢综合症发展的重要因素[7-9]。越来越多的研究表明茶叶中的有效成分能够对肠道中易失调菌群起到有效的调节作用，给动物喂食茶多酚后，可以促进粪便菌群中乳酸菌、双歧杆菌的生长，进而改善细菌微生态平衡[10-11]。高晓余[12]系统研究了普洱茶及其茶多酚、茶多糖、咖啡碱和没食子酸等生物活性成分对基础和高脂饮食小鼠的糖脂代谢、机体炎症和肠道微生态的影响，结果表明：肠道微生物群在调节肥胖、炎症、高血脂、高血压、高血糖、非酒精脂肪肝等代谢性疾病中扮演着重要角色。Chen 等[13-14]利用高通量测序技术研究茯砖茶对小鼠肠道微生物、脂代谢、氧化应激和炎症的影响，结果表明：茯砖茶可能通过调节小鼠肠道菌群结构，调节脂代谢，缓解高脂饮食引起的肥胖。鉴于此，本研究通过对青砖毛茶干预高脂饮食诱导肥胖C57BL/6J 小鼠的主要生理、生化指标分析，明确青砖毛茶的健康功能。利用高通量测序技术分析青砖毛茶对小鼠肠道微生物的影响，并结合相关生理、生化指标进行相关性分析，阐明青砖毛茶调节和改善肠道微生物以实现其健康功能的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青砖毛茶（赤壁群体种，一芽五叶），赤壁赵李桥茶厂。

SPF 级C57BL/6J 小鼠（雄性，6 周龄），南京大学模式动物研究所；高脂饲料（60%的热量来自脂肪，TP26303）、低脂饲料（10%热量来自脂肪，TP26332），江苏南通特洛菲科技有限公司。

总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST），南京建成生物工程研究所；β-巯基乙醇和HE（苏木精-伊红）染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛、二甲苯、无水乙醇、甲醛等试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M2 酶标仪，美国Molecular Devices 公司；IKARA11 basic 分析研磨机、IKA Lab Dancer 涡旋振荡器，德国IKA 集团；ML204 万分一电子天平，美国METTLER TOLEDO 公司；石蜡切片脱水机、包埋机、切片机及其刀片，德国Leica公司；Allegra 64R 台式高速离心机，美国Beckman Coulter 有限公司；血糖仪（活力型），德国Roche 公司；Milli-Q Reference 超纯水机，美国Millipore 公司；DHG-9240A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；DK-8D 电热水槽，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物实验设计 饲养环境：SPF 级动物房，温度20～25 ℃，相对湿度45%～65%，12 h 黑暗/12 h 光照（9：00-21：00）。SPF 级C57BL/6J 小鼠24 只（雄性，6 周龄）自由饮食、饮水，适应1 周实验环境后，随机分为3 组，每组8 只，并记录每组小鼠的体重。低脂组饲喂低脂饲料，饮用纯水；高脂组饲喂高脂饲料，饮用纯水；青砖毛茶组饲喂高脂饲料，饮用青砖毛茶茶汤（茶水比1∶50），即称取3.0 g 青砖毛茶茶样，加入150 mL 沸水，冲泡10 min，过滤。小鼠饮用的茶汤每天更换，并记录饮用量和采食量。每周记录小鼠体重，在第7，12，16 周时监测小鼠的空腹血糖。茶汤干预16 周后，禁食12 h，每组随机取出6 只小鼠进行主要生理生化指标测定和肠道微生物分析。

1.3.2 样品收集与处理 使用4%水合氯醛将小鼠麻醉，摘眼球取血后，脱颈处死，解剖后取小鼠肝脏、脂肪组织、血液、盲肠等实验所需样品。血液：将获得的全血在4 ℃下6 000×g 离心10 min，取血清-30 ℃保存。肝脏组织：取出后立即称重，生理盐水漂洗，取少量放入4%中性甲醛溶液（甲醛∶0.1 mol/L PBS=1∶9，体积比）固定24 h 后，于70%的乙醇中保存，用于组织病理学研究；剩余肝脏于-80 ℃保存。脂肪组织：分类取下附睾脂肪、肠系脂肪和肾周脂肪，称重后液氮速冻，-80 ℃保存。

1.3.3 肝脏组织HE 染色分析 将保存在70%乙醇中的肝脏组织块放置脱水机中脱水，用熔融的石蜡包埋，凝固后用切片机切片（厚度5 μm），取完整切片，将其贴附在载玻片上，55 ℃烘烤约8 h，完成石蜡切片制作。脱蜡、复水后，在苏木精染料中染色10 min，流水冲洗后，再在0.2%伊红酒精染液中浸泡60 s，95%乙醇分色10 s。分色后的切片迅速放于蒸馏水中摇洗3 次，每次5 min，自然晾干后，浸入二甲苯中透明3 min，滴加中性树胶于载玻片，用盖玻片封片后，放入55 ℃烘箱内干燥6～8 h，完成切片染色。将切片置于显微镜下观察组织形态并拍摄照片。

1.3.4 血清相关生化指标测定 血清中TC（COD-PAP 法）、TG（GPO-PAP 法）、HDL-C（直接法）、LDL-C（直接法）、ALT（赖氏法）和AST（赖氏法）均按照试剂盒说明书步骤测定。

1.3.5 小鼠肠道微生物分析 将每组小鼠盲肠取出后，立即收集盲肠内含物，-80 ℃保存并用干冰送到深圳华大基因科技有限公司进行肠道微生物检测。小鼠盲肠内含物DNA 根据提取试剂盒QiAamp DNA stool Mini Kit 说明书提取，利用Illumina Miseq 高通量测序技术对各实验组小鼠肠道中微生物16S rDNA 的V4 高变区的序列进行测定，利用Usearch 软件将有97%相似性的序列归并到一个可操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU），将其与16S 细菌RDP（Ribosomal database project）数据库进行比对并注释种属信息。

1.3.6 数据处理与分析 采用SPSS 17.0 软件进行方差、相关性分析；采用SIMCA-P 13 软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal projections to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA）。

2 结果与分析

2.1 青砖毛茶对小鼠体重、脂肪和肝脏组织的影响

由图1可知，实验16 周后低脂饮食小鼠的体重为（32.20±0.78）g，而高脂饮食小鼠的体重为（45.05±2.02）g，显著高于低脂组小鼠体重；在喂食高脂饲料同时给予青砖毛茶干预后小鼠体重为（41.21±2.55）g，显著降低了高脂引起小鼠体重的增加（P＜0.01）。对各实验组小鼠肝脏质量分析表明（图1），高脂组小鼠的肝脏质量显著高于低脂组，而青砖毛茶干预16 周后能够显著降低高脂饮食小鼠肝脏的质量（P＜0.01）。为进一步了解青砖毛茶对高脂饮食小鼠脂肪积累的影响，分析了肾周脂肪、肠系脂肪和附睾脂肪质量，结果表明（图1）高脂组小鼠的肾周脂肪、肠系脂肪和附睾脂肪质量均明显高于低脂组，且存在极显著差异；青砖毛茶干预16 周后仅能够显著减少肠系脂肪质量（P＜0.05），而对肾周脂肪和附睾脂肪质量无显著性改变。

图1 小鼠体重、脂肪和肝脏组织质量分析Fig.1 Analysis of body weight，fat and liver tissue mass of mice

肝脏是人体重要的生命器官，在物质代谢尤其是脂肪代谢、生物转化上起重要作用，而高脂饮食极易引起脂质代谢异常，形成脂肪肝等病变[15]。通过对实验组小鼠的肝脏表观形态的观察表明（图2a），低脂组小鼠肝脏形态规则，边缘锐利，颜色暗红而有光泽，无油腻感；高脂组小鼠肝脏肿大明显，包膜紧张，边缘较钝，颜色多为发白，有油腻感；青砖毛茶组小鼠肝脏表观形态介于高脂组和低脂组之间，对高脂饮食的小鼠肝脏有不同程度的恢复作用。为了进一步研究青砖毛茶对高脂饮食小鼠肝脏组织形态的影响，采用HE 染色对小鼠肝脏切片进行分析，HE 染色结果如图2b 所示，低脂组小鼠肝细胞大小一致，细胞核清晰，胞浆均匀，而高脂组小鼠肝细胞大面积肿胀，细胞界限不清，脂肪溶解后的空泡明显增加，并呈现出严重的肝损伤现象；青砖毛茶干预后可明显看出脂肪空泡的体积和数量均明显减少，一定程度上改善了高脂饮食引起的肝损伤。

图2 肝脏组织形态观察Fig.2 Morphological observation of liver tissues

2.2 青砖毛茶对小鼠血清中主要生理和生化指标影响

为了系统全面的评价青砖毛茶对高脂饮食小鼠脂代谢的影响，分析了各实验组小鼠血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 等4 个主要血脂指标。由表1可知，高脂组小鼠血清中的TC、TG、HDLC 和LDL-C 含量均高于低脂组，其中仅TG 无显著性差异，其余均存在极显著差异（P＜0.01）；而青砖毛茶干预后能显著降低小鼠TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量，其中HDL-C 存在显著差异（P＜0.05），TC、TG 和LDL-C 存在极显著差异（P＜0.01）。与低脂组相比，青砖毛茶干预后小鼠血清中仅TG 含量要低于低脂组，而无显著性差异；TC、HDL-C 和LDL-C 含量均高于低脂组，其中HDL-C 无显著性差异，TC 和LDL-C 有显著性差异（P＜0.05）。血清中LDL-C 的水平通常被作为衡量动脉粥样硬化的重要指标[16]，说明青砖毛茶有降低动脉粥样硬化发病的能力。研究表明，当肝细胞损伤时，肝细胞内的AST 和ALT 可进入血液中，引起血AST 和ALT 含量升高[17]。为了进一步分析青砖毛茶改善由高脂饮食引起的肝损伤或损伤程度的能力，对血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的活力进行测定。结果表明（表1），高脂组小鼠血清中AST 和ALT 活力极显著高于低脂组（P＜0.01），而青砖毛茶干预后小鼠血清中AST 和ALT 活力显著降低（P＜0.01），且与低脂组无显著差异。

表1 青砖毛茶对小鼠血清中主要生理生化指标的影响Table 1 Effects of Qingzhuan Maocha on the main physiological and biochemical indexes in serum of mice

2.3 青砖毛茶对小鼠肠道微生物的影响

2.3.1 肠道微生物菌群多样性分析 高通量测序表明，18 只小鼠盲肠内含物样品的平均测序深度（Clean reads）为64 950 个，共得到398 个不同的OTU。基于OTU 的相对丰度对各实验组小鼠肠道微生物进行主成分分析表明（图3a），低脂组、高脂组和青砖毛茶组被明显分开，说明3 组小鼠的肠道微生物在OTU 水平上存在较大差异；其次，明显看出青砖毛茶组在Y 轴上的投影逐渐向低脂组移动，说明青砖毛茶干预可以将高脂饮食小鼠的肠道微生物组成逐渐向正常状态移动。为了更好地展示不同实验组小鼠肠道微生物的差异，对获得的398 个OTU 进行维恩图分析表明（图3b），低脂组、高脂组和青砖毛茶组有292 个共有OTU，说明各实验组小鼠肠道微生物种类在OTU 水平上差异相对较小。然而，不同实验组间的肠道微生物种类存在一定差异，如低脂组、高脂组和青砖毛茶组中分别有10，14，16 个特有OTU，说明饮食能够诱导小鼠肠道微生物种类的变化。

为进一步了解低脂组、高脂组和青砖毛茶组小鼠肠道微生物的组成，从门和科水平上对小鼠肠道微生物菌群的相对丰度进行分析。各实验组小鼠的肠道微生物菌群在门水平的影响如图3c所示，小鼠肠道微生物主要是由厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria） 和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，与其它报道结果相似[18]。与低脂组相比，高脂能够显著增加厚壁菌门的相对丰度，并降低变形菌门和拟杆菌门的相对丰度，从而导致厚壁菌门/拟杆菌门比值显著增加，进而可能会导致宿主能量摄取的增强，从而增加患代谢综合征的风险[19]；青砖毛茶干预后可以显著降低厚壁菌门的相对丰度，增加变形菌门和拟杆菌门的相对丰度，从而降低厚壁菌门与拟杆菌门的比例，进而降低患代谢综合征的风险。小鼠的肠道微生物菌群在科水平的影响如图3d 所示，与低脂组相比，高脂能够显著降低脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、S24-7 等相对表达丰度，增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、红蝽杆菌科（Coriobacteriaceae）的相对丰度；青砖毛茶干预后可以增加脱硫弧菌科的相对丰度，降低毛螺菌科、丹毒丝菌科、红蝽杆菌科等的相对丰度。

图3 青砖毛茶对小鼠肠道微生物菌群组成的影响Fig.3 Effects of Qingzhuan Maocha on composition of gut microbiota of mice

2.3.2 青砖毛茶诱导的关键差异OTU 分析 高脂、药物等干预对同一个种属的肠道微生物在OTU 水平上存在较大差异，在OTU 水平上分析肠道微生物的变化具有重要意义[20]。因此，利用SIMCA-P 13 软件对低脂组、高脂组和青砖毛茶组的OTU 相对丰度进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），获得大于1 的关键变量，同时结合相对丰度超过0.1%的OTU（P＜0.05）进行关键差异OTU 筛选。由图4可知，共筛选出71 个关键差异OTU，主要为厚壁菌门/梭菌纲（Clostridia）/梭菌目（Clostridiales）的瘤胃球菌科和毛螺菌科的肠道微生物菌群；部分拟杆菌门/拟杆菌纲（Bacteroidia）/拟杆菌目（Bacteroidales） 和少数放线菌门（Actinobacteria）/红椿菌纲（Coriobacteriia）/红椿菌目（Coriobacteriales）的肠道微生物菌群。与低脂组相比，高脂组增加了34 个OTU、降低了37 个OTU 的相对丰度，青砖毛茶干预增加了33 个OTU、降低了38 个OTU 的相对丰度。由图4可知，共有46 个OTU 在高脂饮食后发生显著改变，后又被青砖毛茶调节回来，其中有25 个OTU 相对丰度因高脂饮食后发生显著降低，而在青砖毛茶干预作用下增加；21 个OTU 相对丰度因高脂饮食后发生显著增加，而在青砖毛茶干预作用下降低。

图4 关键差异OTU 热图分析（相对丰度标准化转换）Fig.4 Analysis of key differentially OTU by heat map（normalized conversion of relative abundance）

2.3.3 关键差异OTU 与生理生化指标相关性分析 将青砖毛茶在高脂饮食小鼠中起显著作用的46 个关键差异OTU 与小鼠的生理生化指标进行相关性分析（图5）。结果表明，其中有39 个OTU与小鼠体重、肝脏质量、肾周脂肪、肠系脂肪、附睾脂肪、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT 和AST 中至少1 个指标呈显著正相关或负相关。相关研究表明，丹毒丝菌科、红蝽杆菌科、红蝽杆菌科和瘤胃球菌科均被报道与代谢综合症密切相关[21-23]。由图5可知，OTU18、OTU7 属于丹毒丝菌科；OTU8、OTU289 属于红蝽杆菌科；OTU28、OTU34、OTU52、OTU55、OTU67、OTU86、OTU88、OTU134 和OTU265等9 个OTU 属于红蝽杆菌科；OTU13、OTU14、OTU33、OTU47、OTU51、OTU62、OTU75、OTU91、OTU111 和OTU261 等10 个OTU 属于瘤胃球菌科；因此推测这些OTU 可能是青砖毛茶在预防和治疗代谢综合征中起重要作用。此外，由图5可知，有20 个OTU 与至少2 个小鼠生理生化指标呈显著正相关，这些OTU 的相对表达丰度被青砖毛茶干预后显著降低；主要包括Oscillospira（OTU14、OTU51、OTU33 和OTU47）、Dorea（OTU265）、Allobaculum（OTU7）、Adlercreutzia（OTU289）、Bac-注：○低脂组和青砖毛茶组OTU 相对丰度少于高脂组；●低脂组和青砖毛茶组OTU 相对丰度高于高脂组；★高脂导致变化的OTU被青砖毛茶恢复回来。热图颜色表示相关性系数；* 和** 表示显著性分别为P<0.05 和P<0.01。teroides_uniformis（OTU260）和Lactobacillus_reuteri（OTU49）。相反的，有9 个OTU 与至少2 个小鼠生理生化指标呈显著负相关，这些OTU 的相对表达丰度被青砖毛茶干预后显著增加；主要包括Bacteroides（OTU74）、Dorea（OTU52）和 Ruminococcus_gnavus（OTU265）。另外，有10 个OTU仅与小鼠TG 含量呈显著负相关，说明这些OTU在青砖毛茶调节小鼠的TG 中起重要作用。综上所述，青砖毛茶干预可以调节高脂诱导的肠道微生物菌群紊乱，并与低脂组有相似的健康肠道菌群组成。

图5 关键差异OTU 相对丰度和主要生理生化指标相关性分析Fig.5 Correlation analysis of key differentially OTU relative abundance and the main physiological and biochemical indexes

3 讨论与结论

肥胖、高血压、高血脂、胰岛素抵抗和高血糖症为特征的代谢综合症已经成为世界范围内的一个重大公共卫生问题。近年来，大量动物实验和临床研究均已经证实了茶叶具有预防和缓解代谢综合症的功能。研究表明，绿茶具有显著的减肥、降血脂、保护肝脏、降血糖的功能。廖素凤等[24]研究认为绿茶提取物能显著降低、高脂饮食引起的体重增加和血清中TC、TG、ALT 和AST 的含量，具有显著降血脂功能；Xu 等[25]研究结果表明绿茶多糖对体重增加和脂肪质量升高有显著的抑制作用，并可以改善大鼠血脂和肝脏氧化应激水平。青砖毛茶通常以较为粗老的中、小叶种茶树鲜叶为原料经杀青、揉捻、晒干等工艺加工而成，在加工工艺和生化成分上与绿茶较为相似。本研究通过对青砖毛茶干预高脂饮食诱导肥胖C57BL/6J 小鼠的主要生理生化指标分析表明，青砖毛茶可以显著抑制高脂饮食诱导的小鼠体重、肠系脂肪、肝脏质量的增加以及血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的增加，与前人的研究结果较为类似。肝脏是机体脂肪合成和脂质代谢最主要的场所，高脂饮食极易引起脂质代谢异常，形成脂肪肝等病变[15]。通过对肝脏表观形态的观察发现，青砖毛茶能够有效缓解高脂饮食小鼠肝脏肿大、肝脏病变等症状；肝脏HE 染色结果表明青砖毛茶干预后可明显降低高脂饮食诱导的脂肪空泡的体积和数量增加。AST、ALT 是反映肝损伤或损伤程度一个重要指标，当肝细胞损伤时，肝细胞内AST 和ALT 可进入血液中，引起血AST 和ALT 含量升高[17]。青砖毛茶干预后小鼠血清中AST、ALT 含量显著降低，且与低脂组无显著差异。因此，青砖毛茶具有缓解高脂饮食诱导的肝脏损伤或病变，保护肝脏的功能。

越来越多的研究表明肠道微生物在茶叶健康功能上扮演着重要的角色。普洱茶、茯砖茶和茶多酚、茶多糖、咖啡碱和没食子酸等茶叶中的主要生物活性成分可能通过调节小鼠肠道菌群结构来调节脂代谢，缓解高脂饮食引起的肥胖[12，20]。本研究利用高通量测序技术对低脂组、高脂组和青砖毛茶组小鼠肠道微生物多样性进行分析表明，3 组小鼠肠道微生物结构和组成在OTU 水平上存在较大差异，且青砖毛茶干预可以将高脂饮食小鼠的肠道微生物组成逐渐向低脂组移动。肥胖与正常人或小鼠的厚壁菌门/拟杆菌门比值显著不同，厚壁菌门/拟杆菌门的比值增加可能会导致宿主能量摄取的增强，从而增加代谢综合征的风险[19]。青砖毛茶干预后可以显著降低厚壁菌门的相对丰度，增加拟杆菌门的相对丰度，降低厚壁菌门与拟杆菌门的比值，进而降低代谢综合征的风险。在科水平上，青砖毛茶干预后可以增加脱硫弧菌科的相对丰度，降低红蝽杆菌科、丹毒丝菌科、红蝽杆菌科等的相对丰度。本研究共筛选出71 个关键差异OTU，其中有46 个OTU 在高脂饮食后发生显著改变，后又被青砖毛茶调节回来。在46 个关键OTU 中有39 个OTU 与小鼠主要生理生化指标中至少1 个指标呈显著正相关或负相关，这些OTU主要属于丹毒丝菌科、红蝽杆菌科、红蝽杆菌科和瘤胃球菌科。饮食诱导肥胖宿主的肠道中比普通个体含有更高丰度的丹毒丝菌科和红蝽杆菌科。丹毒丝菌科可能会增加宿主对食物中能量的提取，并且丹毒丝菌科的相对丰度与宿主中的血脂呈显著的正相关[26]。Martínez 等[21]发现在仓鼠肠道中丹毒丝菌科和红蝽杆菌科的相对丰度与胆固醇代谢物显示出显著的相关性。与此同时，越来越多的研究表明红蝽杆菌科和瘤胃球菌科与代谢综合症密切相关[22-23]。综上所述，青砖毛茶可以调节高脂诱导的肠道微生物菌群紊乱，并与低脂组有相似的健康肠道菌群组成；同时，推测青砖毛茶可能是通过调节厚壁菌门/拟杆菌门的比值和丹毒丝菌科、红蝽杆菌科、红蝽杆菌科、瘤胃球菌科等菌群的相对丰度来缓解高脂饮食引起的代谢综合症。