高糖-氧化应激相关信号通路对各系统疾病的影响

唐柳欢，袁 媛，2，崔校基，蔡 洁，梁 盈*

（1中南林业科技大学食品科学与工程学院 稻谷及副产物深加工国家工程实验室 长沙 410004 2湖南中医药高等专科学校 湖南株洲 412012）

氧化应激是指在体外或体内有害因素刺激下，机体产生过量自由基，细胞内氧化系统和抗氧化系统失衡，氧自由基和相关代谢产物过量聚集，使细胞产生多种毒性作用的状态[1]。引起氧化应激的外在因素包括自身不良的生活方式，如喝酒、吸烟、服用药物等，环境中的污染物、重金属或者石化制品也容易引起氧化应激；内在因素包括机体血糖调节失衡、血脂代谢紊乱、慢性或急性感染等[2]。引起机体各系统如循环系统、泌尿系统、神经系统等氧化应激的原因及其表现形式和发生机制不尽相同。在氧化应激状态下，机体会积累过量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成蛋白质、核酸和脂质等生物分子损伤，进而导致糖尿病、心脏病、阿尔兹海默症、帕金森病等疾病发生[3-5]。

据国际糖尿病联盟报道，2019年全球约4.63亿成人患有糖尿病，其中国内患病人数高达1.16亿；2009—2019年，糖尿病患者人数增长了30%，预计到2045年，全球糖尿病患病人数可达7 亿[6]。机体长期处于高血糖水平会导致广泛的血管损伤，从而影响心脏、肾脏、眼睛和神经。糖尿病患者中，心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）的患病概率比非糖尿病患者高出2～3 倍[7]；糖尿病肾病（Diabetic kidney disease，DKD）的患病率比非糖尿病患者高出10 倍；视网膜病变的患病率高达35%。由于患病率逐年增长，并且并发症多、症状严重，糖尿病现已成为严重的公共健康问题。高糖饮食与糖尿病有密切联系，构建高糖（High glucose，HG） 细胞及动物模型模拟体内高血糖环境，是研究糖尿病生理病理发生机制的有效途径之一。目前大多数研究围绕各种效应物对高糖引起的氧化损伤的保护作用展开，也有少部分研究探讨效应物的作用机制，然而氧化应激相关信号通路的调控在其中的关键性作用甚少报道[8-14]。本课题组长期专注于研究氧化应激作用机制及其相关信号通路[15-18]，结合高糖氧化应激近5年来的研究成果，根据糖尿病及其在机体各系统中的并发症损伤，筛选出与其密切相关的信号通路，并对这些通路进行分析比较，为研究高糖引起的氧化应激及其作用机制提供参考，也为氧化应激的靶向研究提供理论依据。

1 高糖引起氧化应激细胞研究类型的选择

目前研究氧化应激的方法主要有细胞模型法、动物模型法和临床试验。生物体结构复杂，单一功效的效应物通常会引起机体其它连锁反应。临床试验最能直观反映出效应物的作用效果，是效应物实际应用必经之路，需要基于大量动物模型和细胞模型研究，并且要求试验效果稳定可靠、应用价值高，对前期的研究基础要求很高。动物模型法能提供真实的体内环境，准确全面地反应出效应物的功效，然而也具有简单化、不确定性因素多、试验周期较长、指标模糊及物种间差异大等缺点。细胞模型法是利用应激源处理细胞构建模型，破坏细胞内原有正常的氧化还原状态，通过产生损伤细胞的物质，损伤细胞的核酸、蛋白质、脂质等，模拟体内氧化应激的状态[19]。进行氧化应激相关信号通路的研究，细胞模型必不可少。

机体的各个部位或系统均会发生氧化应激，根据研究目的挑选相应的细胞株建立模型，有助于研究应激源的损伤效果和作用机制，准确评价或筛选效应物[20]。糖尿病是一种严重的代谢综合征，会导致多种心血管疾病和其它并发症，高血糖症即是糖尿病的明显病症。血管内皮细胞位于血管内表面，能直接与血液接触，血液中的循环物质如血糖、血脂和炎症因子容易造成内皮细胞损伤，而高血糖可引起内皮细胞损伤已被广泛认可，因此，掌握高糖对内皮细胞的损伤机制对于预防糖尿病对机体的损伤具有重要意义。选用内皮细胞构建糖尿病模型，能直观反应出高糖对细胞的损伤程度以及效应物在细胞内的代谢和利用情况，模拟生物体内氧化应激状态，同时也有利于开展相关信号通路的研究。

糖尿病及其并发症主要损伤人体的循环系统和泌尿系统，对神经系统的损伤也非常大，选择合适的细胞株是构建高糖损伤细胞模型的关键，不同细胞功能各异，发生氧化应激后表现出的症状不尽相同，并且不同细胞对应激源及效应物的敏感程度也不同，需要根据所研究效应物的作用靶点和机制来选择对应的细胞株，才能建立起准确对应生物体内环境的研究模型（表1）。

表1 高糖引起氧化应激常用的细胞模型及其应用Table 1 Common cell models of oxidative stress caused by high glucose and their applications

糖尿病及其并发症中，高糖损伤的系统或器官位点不一，根据研究目的挑选相应系统或器官的细胞株建立高糖损伤模型，有助于开展相关研究。在糖尿病患者中，2 型糖尿病患者占总患病人数的90%[44]，而β 细胞功能障碍和胰岛素抵抗是2型糖尿病及其血管并发症病理生理学中最相关的2 种机制[45-48]。2 型糖尿病患者若持续处于高血糖水平状态易诱发氧化应激，导致心血管损伤[49]，通常采用人脐静脉内皮细胞[21]、人主动脉内皮细胞、大鼠血管内皮细胞和血管平滑肌细胞构建模型。血管内皮祖细胞参与损伤血管的修复，氧化应激反应会减少血管内皮祖细胞的生成，而血管内皮祖细胞的数量影响其对损伤血管的修复程度[24]，因此血管内皮祖细胞常被用作研究模型。在糖尿病的诸多并发症中，心血管疾病是最主要的一种，2/3 以上糖尿病患者都伴随有心血管疾病[50]，氧化还原失衡在心血管疾病中起着重要作用[51]。试验材料常选择大鼠心肌细胞或大鼠心脏成纤维细胞[30]，能相应地表征高糖对心血管细胞或心肌细胞氧化应激的影响[28]。红细胞死亡是糖尿病另一并发症，高糖诱导ROS 过量产生，改变血细胞代谢和生化功能，从而导致红细胞死亡，在这类研究中，红细胞作为研究对象是减轻高糖引起红细胞死亡的有效途径。

糖尿病有多种慢性微血管并发症，DKD 是常见的一种[52]，在糖尿病的并发症中占20%～35%[53]。在终末期肾脏疾病（End-stage renal disease，ESRD） 中，有80%的病例是由糖尿病、高血压或两者共同造成的[7]。高糖会导致内皮细胞出现功能障碍，肾小管上皮细胞出现空泡，肾小管发生纤维化并伴随间质炎症[54-55]，最终导致肾功能衰竭[56-58]。大鼠肾小球系膜细胞[34]、人肾小球系膜细胞[59]、人肾小管上皮细胞、大鼠肾小管导管上皮细胞和足细胞等常被用于构建糖尿病肾脏疾病研究模型。高糖刺激巨噬细胞后导致其趋化功能增强，增加促炎因子分泌，加速DKD 的进展，因此也常选取巨噬细胞作为研究DKD 的对象[38-39]。

在糖尿病慢性微血管并发症中，另一种最常见也是最主要的并发症是糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR），2015年全球有1.45 亿人患有DR，糖尿病患者中DR 的患病率高达35%，增生性视网膜病变患病率为7%[7]。大多数糖尿病患者失明与DR 有密切联系[60]，常选取人视网膜内皮细胞、小鼠视网膜上皮细胞和视网膜神经节细胞作为研究对象，高糖改变了视网膜相关细胞的结构和功能，导致视野缺损，并最终导致失明[61]。由于高糖导致氧化或抗氧化防御系统能力降低，会触发神经细胞死亡，引起神经病变，局部神经调节剂在介导或预防高糖引起的神经毒性中起着重要作用。鼠肾上腺嗜铬细胞瘤暴露于神经生长因子下时呈现神经元表型，能构成作为研究高糖水平引起不利神经元效应机制的模型[43]。人神经母细胞瘤细胞具有类似于正常神经细胞的生物学特性，也常被用于研究高糖诱导的神经毒性[42]。

2 高糖引起的氧化应激相关细胞信号通路

糖尿病与氧化应激的联系非常密切，当机体处于氧化应激状态时，自由基的含量会大幅增加，包括ROS 和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）。自由基不仅对细胞产生直接损伤，还会调控多条信号通路，如核因子-κB（NF-κB），Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1-核因子E2 相关因子2/抗氧化反应元件（Keap1-Nrf2/ARE），p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK），胎盘生长因子/细胞外调节蛋白激酶（PIGF/ERK），磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等[62-64]，进而导致机体组织损伤。氧化应激调控的信号通路涉及多种生理病理反应，在应激反应过程中起着不可替代的作用，研究对应的细胞信号通路有助于探明效应物的作用机制及作用靶点。

2.1 高糖引起的氧化应激与NF-κB 信号通路的关系

众多研究发现，NF-κB 信号通路在细胞氧化应激相关的心血管疾病中起着关键作用[65-67]，NFκB 信号传导是调节ROS 产生和炎症的经典途径[68]。该途径的激活可以增加ROS 的产生并加速氧化应激进程，进而引起内皮功能障碍。糖尿病患者细胞内生成的ROS 会通过信号传导致使NFκB 解离，二聚体结构消失，NF-κB/p65 亚基被继续修饰，并由细胞质进入细胞核，导致NF-κB 核转位[69-71]。Fei 等[72]研究证实NF-κB 信号转导途径是高血糖引起内皮功能障碍的关键致病机制，高糖处理人脐静脉内皮细胞后，激活了NF-κB 和MAPK 信号通路，并证明囊性纤维化跨膜电导调节剂通过抑制NF-κB 和MAPK 信号传导，减轻高糖诱导的内皮细胞氧化应激和炎症。

2.2 高糖引起的氧化应激与Keap1-Nrf2/ARE信号通路的关系

Nrf2 是一种转录因子，在稳态条件下位于胞质溶胶中，在调控氧化应激保护性通路中发挥着重要作用。研究高糖引起的心血管疾病时，Keap1-Nrf2/ARE 信号通路也常被当做另一重点研究对象。在高糖刺激下，Keap1 启动子发生甲基化，激活自身的转录，使得Nrf2 多泛素化，蛋白酶体降解减弱[73]，进而使得细胞核中Nrf2 的水平快速增加[74]，间接参与细胞抗氧化应激[75]。Zuo 等[76]研究发现，HG 诱导的足细胞损伤与DKD 的发病机制密切相关，含溴结构域蛋白4（BRD4）在HG 刺激后表达量显著增加，抑制BRD4 会促进Nrf2 核易位并上调Nrf2 和ARE 的转录活性，进而减少HG 对足细胞的损伤，表明Nrf2/ARE 与DKD 的发病机制有关。

2.3 高糖引起的氧化应激与p38 MAPK 信号通路的关系

DKD 的发病机制与多条信号通路有关，在这些相关的通路中，p38 MAPK 信号通路起着关键作用[77]，主要与细胞凋亡相关，常被用于研究高糖引起的DKD 等相关机制的靶途径。磷酸化p38 MAPK 对细胞增殖、生长和分化有促进作用[78-79]。高糖引起细胞氧化应激，激活p38 MAPK 通路，引起一系列反应如肾小球硬化，激活后的p38 MAPK 通路又反过来加重氧化应激状态。姚新明等[34]用高糖培养大鼠肾小球系膜细胞，发现高糖引起肾小球系膜细胞氧化应激，也导致磷酸化p38 MAPK 的蛋白质水平比正常状态高，而这些变化可以被p38 MAPK 抑制剂和抗氧化剂减轻；表明该细胞中p38 MAPK 通路被高糖激活，同时p38 MAPK 的活化又会反过来加重氧化应激的程度，导致氧化损伤。其它相关研究也证明高糖通过介导p38 MAPK 途径引起氧化应激，如Wang等[37]研究发现HG 通过AMPK / p38 MAPK 途径引起氧化应激，诱导大鼠肾小管导管上皮细胞凋亡。在DR 的相关研究中，效应物通过抑制p38 的活化调节MAPK 信号通路，达到抑制氧化应激的效果[8]。

2.4 高糖引起的氧化应激与PIGF/ERK 信号通路的关系

高糖诱导的DR 发病机制中，PIGF/ERK 信号通路起关键作用[80]，促血管生成和炎症因子上调，如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）[41]。HG 刺激细胞后，VEGF-A 和PIGF 与受体VEGFR1 结合导致p38 MAPK 及ERK 1/2 的激活和磷酸化，MAPK 反过来可以影响VEGF 水平，引起ERK 途径下游的炎症因子TNF-α 表达量上升。同时ERK 途径可通过调节NF-κB 依赖性基因表达影响NF-κB 的活化。Lazzara 等[41]发现PIGF 抑制剂可缓解高糖引起的DR，表明PIGF 是治疗糖尿病性视网膜病变的选择性靶标。

2.5 高糖引起的氧化应激与PI3K/AKT 信号通路的关系

PI3K/AKT 通路在细胞中普遍存在，内皮细胞处于氧化应激状态时引起的衰老等病症都与PI3K/AKT 信号传导途径密切相关[81]。胰岛素主要通过PI3K/AKT 信号通路介导的葡萄糖稳态和脂质代谢等细胞关键生理过程调控血糖水平[82]。PI3K/AKT 信号通路被激活后，诱导P53 蛋白表达水平升高，进而参与细胞衰老和凋亡[83]。除了这些重要的细胞因子外，与AKT 相关的抗凋亡基因Bcl-xl，能促进AKT 磷酸化，进而保护内皮细胞[84]。Zhang 等[85]研究发现，高糖诱导细胞凋亡后，AKT 的磷酸化会被高糖抑制，从而抑制下游相关因子的功能，降低细胞抵御氧化应激的能力[39，86-87]。

2.6 高糖引起的氧化应激与线粒体相关信号通路的关系

线粒体是细胞产生能量的重要部位，同时也是ROS 产生的重要场所。ROS 的浓度处于正常范围时，能调节细胞增殖、分化和激素合成。当机体处于高糖引起的氧化应激状态时，过量的ROS 会加速蛋白质、脂质和DNA 等分子氧化，导致线粒体功能障碍。Fan 等[88]的研究发现，在足细胞中通过Sirt6 质粒转染，激活了AMPK 通路，显著改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍。Raj等[89]研究表明，SERCA 途径的细胞内钙超负荷和线粒体完整性的改变是高糖引起氧化应激的主要原因。Abuarab 等[90]研究表明，高糖诱导的ROS 激活了TRPM2 通路，从而触发溶酶体膜通透性改变和Zn2+介导的线粒体裂变。

2.7 高糖引起的新型氧化应激信号通路

目前对于高糖引起的氧化应激在各系统疾病中的研究均是围绕上述几条常见的细胞氧化应激信号通路展开的，近几年一些新型的氧化应激信号通路也随着研究的深入逐渐被研究者们发现，如Batchuluun[91]研究发现，高糖暴露导致PKCβ2易位和内源性PKC 磷酸化、p47 phox 易位和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶激活，并导致细胞内二酰甘油（DAG）水平和AMPK 磷酸化水平升高，效应物二甲双胍和利拉芦肽通过抑制PKC-NADPH氧化酶途径改善高糖诱导的氧化应激。Ying[92]发现激素FGF21 可能通过CaMKK2/AMPKα 介导的氧化应激抑制和eNOS 激活，改善1 型和2 型糖尿病小鼠的主动脉扩张。激素FGF21 与受体FGFR结合可以增强CAMKK2 和AMPKα 活性，AMPKα可上调CAT、NRF-2 和HO-1 的表达，增强eNOS的活性，从而减轻高糖引起的氧化应激。Ren 等[93]发现，高糖可抑制SIRT1 和AMPKα 的活性，导致FoxO1 活性增强，引起氧化应激，二甲双胍通过调节AMPK/SIRT1-FoxO1 途径，改善大鼠系膜细胞的氧化应激，从而延缓DKD 的发展。Li 等[94]发现高糖处理使大鼠心肌细胞中磷酸化的转录激活因子3（p-STAT3）与转录激活因子3（STAT3）的比值变大，HIF-1α 蛋白表达水平上调，表明高糖诱导了STAT3/HIF-1α 途径的激活。

3 高糖引起的氧化应激相关信号通路及其相互关系

近几年随着研究技术的发展，关于各系统疾病中高糖引起的氧化应激相关信号通路的研究，在广度和深度上逐步提升，本文总结了近5年来相关通路的文献报道，并比较各通路在机体不同系统中的研究比重（图1）。

图1 高糖引起的氧化应激相关信号通路近5年文章发表数Fig.1 The number of articles on high glucose-induced oxidative stress-related signaling pathways published in the recent five years

当人体空腹血糖大于或等于7.0 mmol/L 时，可诊断为糖尿病。餐后血糖升高为正常的血糖波动，非糖尿病患者在餐后一段时间内因胰岛素的调节会恢复到正常血糖水平，而糖尿病患者调节机制受阻，致使血糖浓度持续偏高，影响着人体各个系统。高糖的作用机制错综复杂，介导的各信号通路之间既有各自特有的作用机制，又相互影响。高糖能直接作用于PIGF/ERK 通路，引起炎症因子VEGF 上调并且与受体结合，导致ERK1/2 激活和下游炎症因子TNF-α 表达量上升，从而引起炎症；同时VEGF 上调也导致p38 MAPK 活化和磷酸化，与高糖引起的过量ROS 共同作用，促进p38 MAPK 磷酸化和入核，引起氧化应激；MAPK也能影响VEGF 水平，进一步导致TNF-α 表达量上升；而ERK1/2 能影响NF-κB 的活化，协同ROS 导致NF-κB 解离，NF-κB/p65 亚基入核。高糖刺激后Nrf2 从Keap1 上解离，ROS 导致的IKKα/β 被激活，IκB 磷酸化，同样会促进Nrf2 从Keap1 上解离，解离后Nrf2 入核，在核中与ARE结合，打破细胞稳态。高糖抑制AKT 的磷酸化，促进Nrf2 入核和HO-1 的活化，进而引起氧化应激（图2）。

图2 高糖引起的氧化应激相关信号通路之间的关系Fig.2 Relationship between oxidative stress-related signaling pathways caused by high glucose

4 小结

随着研究不断深入，高糖引起的氧化应激涉及的相关信号通路逐渐被发现，如STAT3/HIF-1α、CaMKK2/AMPKα 等。氧化应激状态在不同系统中所涉及的调控通路不同，而各通路间又有交互作用，因此寻找到各系统对应的靶通路及靶位点，进而对氧化应激过程进行精准调控是抑制氧化应激的有效途径。在众多相关研究中，由于效应物、细胞类型以及验证的信号通路具有多样性，对这些研究进行综合性报道意义重大。本文对目前的相关研究进行总结，归纳出高糖构建氧化应激模型中常用的细胞类型，统计出各通路的研究侧重点并总结出各通路间的交互作用，为后续的深入研究和探究新效应物在抑制高糖引起的氧化应激中的作用机制提供理论参考。