鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB与靶基因的作用机理分析

潘 永，杨 阳，段世宇，杨 琦,3*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

sRNA(small RNA)是长度为40～500 nt的主要调控基因转录后表达的短非编码RNA，在原核生物中广泛存在，此前相关研究主要集中于大肠杆菌和沙门菌[1]。多项研究结果表明，sRNA调控着多种基因，这些基因编码与细菌生理、代谢、应激反应和群体感应等有关过程中涉及的蛋白质[2-5]。许多sRNA能够调节多种靶mRNA，一种靶mRNA可受多个sRNA调节，从而形成了一个基于sRNA的复杂网络，体现了它们在基因转录后调控中的重要作用。sRNA降低了细菌代谢所消耗的能量并提供了更紧密，更快速的基因调节，可帮助细菌适应新环境。sRNA GcvB是一段仅有206个核苷酸组成的短非编码RNA分子，在细菌中比较保守，大肠杆菌和沙门菌gcvB基因RNA序列相似度高达95%。研究表明，GcvB主要调控沙门菌ABC转运蛋白的表达[6]。GcvB通过3个特殊保守单链核苷酸序列R1、R2或R3与靶mRNA对应序列完全或部分碱基互补配对，从而抑制或促进mRNA的翻译[7-9]。此前，仅探明GcvB直接调控30余种mRNA，相信还有大量GcvB靶基因未被挖掘。MIYAKOSHI等[10]最近在研究与鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium LT2，STM LT2)sRNA GcvB产生拮抗作用的mRNA 海绵SroC时，通过微阵列分析筛选到部分受GcvB调控的基因，但这些基因是否受GcvB直接调控目前尚未验证。

研究表明，GcvB在细菌对数期早期表达量最高，随着生长周期往后的推移，表达量水平下降直至稳定期几乎检测不到，因此本研究仅分析各基因转录水平在STM LT2对数早期时的变化[11]。本试验根据GcvB特性，利用无痕基因重组技术构建STM LT2ΔgcvBR1、STM LT2ΔgcvBR2和STM LT2ΔgcvBR3菌株，并设计合成荧光定量PCR引物，通过相对荧光定量PCR技术检测各基因在不同菌株中的转录水平变化，最后进一步分析各基因与GcvB 3个功能区的关系，旨在挖掘STM LT2 sRNA GcvB潜在靶基因并探明其与GcvB的作用方式，为阐明沙门菌致病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及主要试剂野生型STM LT2株被命名为3409(GenBank ID：AE006468.2)，STM LT2ΔgcvB株被命名为10241；无痕基因重组系统涉及质粒pKD46为同源重组的辅助质粒,含有温度敏感复制子,37℃及以上培养可去除，20%阿拉伯糖诱导后能够表达Gam、Beta和Exo 3个λ噬菌体重组酶；pKD3含氯霉素(cat)抗性基因，为重组转化子提供筛选标志；以上所有材料均由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠。Pfu和Taq DNA聚合酶均购自北京索莱宝科技有限公司;PCR产物纯化试剂盒和RNA提取试剂TRIzol均购自上海生工生物有限公司;胶回收试剂盒、反转录试剂盒HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)以及荧光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix皆购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 引物的设计与合成如表1所示，双横线表示碱基与3409 的基因序列同源，为无痕基因重组提供同源臂。单横线标示碱基与pKD3质粒序列同源，其中gcvB-R与cat-F反向互补，cat-F与cat-R扩增得到氯霉素抗性(cat)基因序列，为无痕重组提供筛选标记。gcvBR1-F、gcvBR2-F和gcvBR3-F已分别删除功能区R1(5′-GTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGC-3′)、R2(5′-ACTTCCTGT-3′)和R3(5′-TACCCTGTCTGTCCATAGTGATTAAT-3′)。无横线引物中除aF和aR外皆为荧光定量PCR引物，本试验以16S rRNA为内参基因，所有引物通过Primerselect软件设计并由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3 STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株的构建

1.3.1SOE-PCR结合Touchdown PCR制备无痕基因重组目的片段 通过SOE-PCR技术分别将删除R1、R2和R3的部分gcvB基因与氯霉素抗性(cat)基因融合，扩增分为两步：第1步以3409总DNA为模板，分别以(gcvBR1-F,gcvB-R)、(gcvBR2-F,gcvB-R)和(gcvBR3-F,gcvB-R)为引物进行扩增；以pKD3为模板，以(cat-F,cat-R)为引物进行扩增，取25 μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收。第2步分别取上述前3个反应的胶回收产物逐一与第4个混合(1∶1)作为模板，同时分别以gcvBR1-F和cat-R、gcvBR2-F和cat-R以及gcvBR3-F 和cat-R为引物进行扩增。上述所有反应体系均为：模板DNA 100～200 ng，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，Pfu DNA Polymerase(5 U/μL)0.25 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.75 μL，10 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，10×Taq Buffer 6 μL，ddH2O补足80 μL。所有扩增反应均使用Touchdown PCR程序：95℃ 6 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 90s，循环5次；95℃ 10 s，53℃ 30 s，72℃ 90 s，循环20次；72℃ 8 min。取10 μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，若无特异性条带则将剩余产物用产物纯化试剂盒回收并测量DNA浓度。

1.3.2无痕基因重组反应 第1步：按1∶100取3409过夜菌液于5 mL 液体LB中30℃ 170 r/min振荡培养至D600 nm≈0.5，冰浴10 min后用10%甘油洗涤3次,取50 μL 10%甘油悬浮即为电转化感受态细胞，将1 μL pKD46(100～200 mg/L)与50 μL 感受态细胞混合并转入0.2 cm的Bio-Rad电极杯中，按Bio-Rad电转仪预设参数(2.5 kV,5.8 ms)电击转化并迅速加入1 mL预冷的SOC复苏液，将杯内液体转入无菌空试管并于摇床30℃ 170 r/min条件下培养1 h，取100 μL涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板30℃过夜培养，次日挑单个阳性菌落过夜培养。第2步：取400 μL阳性菌过夜培养物及26μL 20%阿拉伯糖溶液于40 mL液体LB 30℃培养至D600 nm≈0.5，10%甘油洗涤5次并用100 μL 10%甘油悬浮制备电转化感受态细胞，取上述纯化的PCR产物100～200 ng与50 μL感受态细胞混合后电击、37℃复苏以及200 μL涂于氯霉素抗性平板37℃过夜培养，次日挑单个菌落以a-F和a-R为引物进行PCR及测序鉴定。电击杯中PCR产物体积原则上不超过感受态细胞体积的10%，感受态细胞的制备全程于冰上操作且全程需注意无菌操作。

1.4 细菌总RNA的提取分别将3409、10241、STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔ R2和STM LT2gcvBΔR3菌株的过夜培养物按1∶100接种于5 mL液体LB中，除3409外其余均添加终质量浓度为25 mg/L的氯霉素，37℃ 170 r/min振荡培养至D600 nm≈0.4，然后根据TRIzol说明书提取总RNA并测量浓度，产物保存于-80℃。

1.5 cDNA的制备分别取总RNA产物按反转录试剂盒说明书先进行去基因组处理然后反转录，cDNA置-20℃保存。

1.6 荧光定量PCR检测基因转录水平通过普通PCR对GcvB调控基因的荧光定量PCR引物进行特异性检测后，通过荧光相对定量法检测各基因在不同基因型菌株中的转录水平，反应体系：2×AceQ SYBR qPCR Master Mix10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补足20 μL。反应条件为95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循环40次；熔解曲线分析：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每个样设3个重复,以16S rRNA cDNA作为内参基因，结果根据2-△△Ct法计算全部基因在不同基因型菌株中的相对表达水平[12]。

2 结果

2.1 基因敲除菌株的构建通过SOE-PCR结合Touchdown PCR制备同源重组目的片段并利用无痕基因重组系统构建STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株。结果显示，以a-F和a-R为引物通过PCR分别扩增包含gcvB在内的基因片段后，琼脂糖凝胶电泳检测出现与预期值一致的条带(图1)。测序分析结果对比3409gcvB基因序列(图2)显示，gcvB基因R1(图3)、R2(图4)和R3(图5)已被成功敲除。结果表明，STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株已被成功构建。

M.DL2000 DNA Marker;A1.3409;A2.gcvBΔR1;A3.gcvBΔR2;A4.gcvBΔR3;A5.Blank control

GcvB.1～206 nt;R1.65～93 nt;R2.136～145 nt;R3.150～175 nt

图3 STM LT2 gcvBΔR1株测序(A)和色谱(B)结果

图4 STM LT2 gcvBΔR2株测序(A)和色谱(B)结果

图5 STM LT2 gcvBΔR3株测序(A)和色谱(B)结果

2.2 荧光定量PCR检测基因转录水平对GcvB调控基因的荧光定量PCR引物特异性检测后进行荧光定量PCR检测各基因在不同基因型菌株中的转录水平变化。结果显示，STM LT2gcvBR1、gcvBR2或gcvBR3单敲除使fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因转录水平出现与gcvB单敲除时一样大于2倍的下调变化，STM0276、exbD和sodA基因在gcvB、gcvBR1或gcvBR2单敲除时均出现转录水平下调大于2倍的变化，trpE和yifK基因则在gcvB或gcvBR3单敲除时出现转录水平上调大于2倍的变化(图6)。以上结果表明，GcvB 调控fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因的表达与功能基序R1、R2和R3相关；调控STM0276、exbD和sodA基因表达与功能基序R1和R2相关；调控trpE和yifK基因表达与功能基序R3相关。

图6 GcvB调控基因在不同基因型菌株中的转录表达水平

3 讨论

Red同源重组技术常被应用于对细菌进行染色体基因定点修饰，该技术可精确地实现基因敲除、敲入及各种突变体的引入[13]。通常用抗性基因将原来的基因替换而达到敲除目的，进一步引入可表达FLP酶的质粒通过识别抗性基因两侧的FRT位点酶切抗性基因序列达到去除筛选基因目的，而这将留下一段30个核苷酸长的FRT序列[14]。为分析STM LT2 GcvB R1、R2和R3在所调控基因中是否发挥作用，本试验在gcvB基因下游引入抗性基因，成功构建STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR1 STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株，测序结果表明各菌株gcvB基因除功能区被删除外完整性未被改变，实现了基因的无痕敲除。

sRNAGcvB为反式编码RNA，通常与靶标形成10～25个碱基对的sRNA-mRNA双链结构，而GcvB与mRNA的结合区域目前已鉴定的有R1、R2和R3，3个功能基序通常以1个或以上与靶mRNA结合[15]。LALAOUNA等[9]认为，已鉴定的GcvB靶基因中，79%通过核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)与GcvB结合，15% 以CDS上游区域与GcvB作用，6%则以CDS下游区域作为GcvB靶位点。大多数情况GcvB通过干扰30S核糖体亚基结合来阻断翻译起始[16]。此外，GcvB也通过封闭翻译增强子原件(富含C/A的序列)而有效抑制翻译[7,17]。最近的研究证明，GcvB与mRNA配对并募集Rnase E来促进mRNA降解，这解释了本研究中dppA、oppA、yifK和STM4351基因在转录水平发生不同变化的原因。这4个基因是已被验证的GcvB直接调控靶标，均与沙门菌氨基酸摄取有关，gcvB基因的敲除均使它们在蛋白水平发生显著上调变化[7,17]。而本研究中dppA和yifK基因在gcvB敲除后转录水平与蛋白水平均显著上调，同样的处理，oppA和STM4351基因转录水平却未发生改变，而GcvB是转录后调控sRNA，分析认为这是GcvB不同的作用方式产生的结果，GcvB对dppA和yifK基因的作用机理或许为募集RNase E使其降解，对oppA和STM4351基因则通过封闭mRNA翻译功能区阻碍翻译的进行但不使mRNA降解，可能封闭30S核糖体亚基结合区域、富含C/A增强子区域或其它未被探明的序列，具体作用机理有待深入研究。

一直以来，对GcvB靶基因的挖掘主要局限于受其负调控的基因，而研究发现，沙门菌gcvB基因敲除后转录水平显著下调的基因接近8%，当中相信还有许多未知正调控靶标及作用机理未被揭示[18]。现在已经记录了一些sRNA正调控mRNA激活翻译和稳定mRNA的例子，如sRNA SgrS与靶mRNA pldB碱基互补配对使RNase E识别序列被SgrS隔离从而避免mRNA被降解；同样sRNA CsrA与大肠杆菌中的fhlDC mRNA的相互作用通过独立于任何辅助sRNA的机制保护转录本不受RNase E的降解也是sRNA正向调控靶基因的例子[19]。本研究荧光定量PCR结果中fhuA、aphA、STM2714、STM0298、STM1827、STM0276、exbD和sodA基因分别与沙门菌的外膜蛋白受体/亚铁蛋白、大肠菌素M和噬菌体(T1、T5及phi80)的转运蛋白、非特异性酸性磷酸酶/B类磷酸转移酶、Fels-2噬菌体蛋白、推定整合酶核心结构域蛋白、假定的双鸟苷酸环化酶/磷酸二酯酶、推测的胞质蛋白、肠螯合素的摄取和超氧化物歧化酶相关，这8个基因在转录水平均下调，对GcvB相应功能区进行敲除后也出现与gcvB基因完全敲除时一样的转录水平变化，预示GcvB对这些基因进行直接的正向调控，并推测GcvB R1、R2和R3对fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因发挥调控作用，R1和R2对 STM0276、exbD和sodA基因发挥调控作用，而这种调控机制可能是由于GcvB功能基序与RNase E竞争和mRNA的结合区域导致mRNA无法被核酸酶降解。