河北省奶牛场牛呼吸道疾病综合征病原分离鉴定

高亚桃，王紫燕，马亚宾，蒋桂娥，倪俊卿，张明勇，李 妍，武二斌，秦建华*，赵月兰*

(1.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001;2.河北省畜牧良种工作站，河北 石家庄 050061；3.怀来县畜牧水产局，河北 张家口 075400;4.张家口市畜牧技术推广站，河北 张家口 075000)

牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)是一类多病原多因素的传染性疾病，可引起牛肺炎、运输热、支气管炎等病症[1]，引发该病的病原种类繁多，包括牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus stype 3,BPIV3)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae，Kp)、牛支原体(Mycoplasmabovis,MYPB)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)等[2-6]。近年来，该病在国内外常见报道，多呈地方性或散发性流行，严重危害养牛业的发展[7]。此外，此病多病原混合感染的病原种类增加、病原体之间的相互作用，可导致病症加重、病情复杂，使得该病的诊断和治疗更加困难，给养牛业造成巨大的经济损失[8]。为了解河北省部分地区规模化奶牛场BRDC病原种类，本试验自河北省不同地区不同牛场奶牛呼吸道疾病临床病例采集病料，进行病原的分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 引物的设计与合成根据GenBank公布的 BVDV、IBRV、BRV、BPV、Pm、Kp、MYPB和Mh参考基因组序列，利用 Primer5 软件设计8对特异性引物，由上海生物工程股份有限公司合成。引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息

1.2 被检样品自河北省张家口、秦皇岛、保定、衡水、沧州、石家庄、邯郸等地区规模化奶牛场采集奶牛呼吸道疾病临床病例鼻拭子样品及死亡奶牛的肺脏组织样品，共计56份。将所采集病料用IBRV、BRSV、BPIV3、BCV和BVDV基因特异性引物进行PCR扩增，PCR检测结果为IBRV和BVDV阳性，初筛阳性的样品进行IBRV和BVDV分离鉴定。用Pm、Kp、MYPB和Mh基因特异性引物进行PCR扩增，初检结果Pm、Kp阳性，将筛阳性的样品进行细菌Pm和Kp分离鉴定。

1.3 毒株和细胞BVDV标准毒株(Oregon C24V)、BVDV标准阳性和标准阴性血清、IBRV标准毒株(HVRI-IBRV-004)、IBRV标准阳性和标准阴性血清、MDBK细胞等，均购自中国兽医药品监察所。

1.4 培养基和主要试剂细菌分离用培养基、生化鉴定常规试剂及PCR试剂，均购自当地生物公司或化学试剂公司。

1.5 BVDV和IBRV的分离与鉴定

1.5.1病毒的分离培养 初检IBRV和BVDV阳性样品采取常规方法进行样品处理。取1份鼻拭子样品，加入适量Hanks 处理液；1份肺脏研磨样品，加4倍生理盐水，用振荡器振荡混匀，反复冻融后以3 000 r/min离心15 min，上清液用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，用于病毒的分离。

待MDBK传代细胞长成单层后，用PBS洗3次，按细胞量的1/10将被检样品处理液接种于MDBK细胞，经37℃吸附2 h后加入细胞维持液，置37℃培养箱培养，每日镜检观察细胞病变(CPE)，5 d后收获细胞培养物，备用。同时设正常细胞和接标准株OregonC24V、HVRI-IBRV-004的细胞作对照。盲传3代。待90%～95%的细胞产生细胞病变(CPE)时收取病毒培养物，倒掉大部分细胞培养液，反复冻融3次，3 000 r/min离心5 min，取病毒上清液经PEG(聚乙二醇)和NaCl浓缩、TNE缓冲液洗脱，制备PEG浓缩病毒。-20℃保存备用。

1.5.2病毒的PCR鉴定及测序鉴定 BVDV的鉴定采用RT-PCR方法，IBRV的鉴定采用PCR方法。利用病毒DNARNA提取试剂盒(全式金生物科技有限公司)提取病毒基因组DNARNA,具体操作步骤按说明书进行。以提取的基因组RNA为模板，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)反转录合成cDNA。病毒基因组RNA的反转录具体操作步骤按说明书进行。以BVDV的cDNA为模板，BVDV特异性引物P1/P2(表1)进行BVDVE0基因片段的PCR扩增。以提取的IBRV DNA为模板，用IBRV特异性引物P3/P4(表1)进行IBRVgB基因片段的PCR扩增。分别取5 μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将其PCR扩增产物进行胶回收纯化，送往上海生工生物工程有限公司进行测序，并对测序结果进行序列分析，与GenBank上所公布的部分其他毒株的核苷酸序列进行同源性比较，并通过系统发生树分析该分离株与其他毒株之间的亲缘关系。

1.6 Pm与Kp的分离与鉴定

1.6.1Pm与Kp的分离培养 无菌取初检Pm与Kp阳性鼻拭子样品，肺脏内部组织剪碎、研磨，加入适量Hanks液匀浆处理，用于细菌的分离鉴定。取鼻拭子与肺脏处理液，分别划线接种于绵羊血琼脂平板培养基和麦康凯培养基上，37℃恒温培养24 h。挑取血平板上可疑单菌落进行革兰染色、镜检，观察是否符合Pm的形态特征。取阳性菌落接种于5 mL 含犊牛血清的TBS液体培养基中过夜培养，纯化培养后进行下一步生化鉴定。

挑取麦康凯培养基上可疑单菌落进行革兰染色、镜检，观察是否符合Kp形态特征。取阳性菌落接种于5 mL含犊牛血清的TBS液体培养基中过夜培养，再次接种于西蒙柠檬酸盐培养基上，37℃鉴别培养48 h后，挑取单一菌落进一步镜检，观察是否符合Kp的形态特征，取阳性培养液纯化培养后进行下一步生化鉴定。

1.6.2Pm与Kp分离菌株的生化鉴定 取Pm纯培养物接种于糖微量发酵管(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖)，进行糖发酵。同时进行甲基红(MR)试验、吲哚试验、V-P试验、靛基质试验、麦康凯试验、触酶试验及β溶血性试验等，37℃培养 24～72 h，观察并记录结果。

取Kp纯培养物分别进行糖发酵试验、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验、枸盐酸盐利用试验、吲哚试验、V-P试验、靛基质试验、MR试验、丙二酸盐试验、尿素分解试验，观察并记录结果。

1.6.3Pm与Kp分离菌株PCR鉴定与序列分析 取Pm和Kp分离株细菌纯培养物，进行细菌DNA的提取，参照细菌DNA提取试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司)进行具体操作。以提取的细菌DNA为模板，分别用Pm特异性基因kmt引物F1/F2和Kp特异性基因phoE引物F3/F4(表1)进行PCR扩增，取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收纯化目的片段，具体按照DNA快速纯化回收试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司)进行。纯化后的PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序，应用DNAstar软件分别对kmt和phoE基因核苷酸序列进行分析。

1.6.4Pm与Kp分离菌的致病性检测 取健康小鼠20只，随机分为试验组和对照组，每组10只。将肉汤培养的待测菌液(5×108CFU/mL)腹腔接种于试验组小鼠，0.2 mL/只；对照组小鼠注射等量生理盐水，观察72 h。剖检死亡小鼠，并记录病理变化。无菌采集死亡小鼠对心脏和肝脏，涂片、染色、镜检及细菌分离培养，方法同前。

1.6.5Pm与Kp分离菌的药物敏感性试验 选取16种常用抗生素药敏片，按世界卫生组织(WHO)推荐的 Kirby-Barer法进行，取待检菌液均匀涂布琼脂平板表面，待菌液吸附后，将各种定量浓度抗菌药圆纸片分别贴于培养基表面，37℃培养24 h后观察结果，根据药物纸片有无抑菌圈及其大小来判断该菌对各种药物的敏感程度。

2 结果

2.1 BVDV和IBRV的分离培养结果

2.1.1BVDV的分离培养结果 初检BVDV阳性样品处理液接种于MDBK细胞，37℃培养，盲传至第3代时开始出现细胞病变(CPE)，主要表现为细胞变圆、细胞核固缩到边缘、细胞内空泡、脱落、拉网、空斑，与BVDV标准毒株OregonC24V结果一致(图1)。将分离毒株命名为HB-BDZ。

A.正常MDBK细胞;B.分离毒(CPE);C.OregonC24V(CPE)

2.1.2IBRV的分离培养结果 初检IBRV阳性样品处理液接种于MDBK细胞，37℃培养，连续盲传 3 代筛选出病变稳定的毒株，可见细胞皱缩变圆，继而细胞出现拉网现象、细胞大量脱落等细胞病变(CPE)，与IBRV标准毒株HVRI-IBRV-004结果一致(图2)。将分离毒株命名为HB-XTZ。

A.正常MDBK细胞;2.分离毒(CPE);3.HVRI-IBRV-004(CPE)

2.2 BVDV和IBRV的 PCR鉴定及测序分析

2.2.1BVDV的PCR鉴定及序列分析 提取病毒基因组RNA，RT-PCR方法扩增BVDVE0基因,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现约686 bp的目的片段，与预期结果一致(图3)。PCR结果进一步表明，分离毒株HB-BDZ为BVDV。序列测定结果表明，分离毒HB-BDZ株E0基因扩增片段为686 bp，与预期长度相同。序列同源性分析结果显示，分离毒HB-BDZ株E0基因序列与GenBank中发表的BVDV国外NADL株(AJ133739.1)、国内毒株HB-DCZ 株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、BJ-2013株(MH490942.1)、国外毒株1-SD1(M96751.1)、Powder株(JN380089.1)、6010株(JN380080.1)、180株(HQ174292.1)、2724株(S71487.1)、Oregon C24株(AF091605.1)、国内毒株GS8株(KY675205.1)、国外毒株SLO/2407/2006株(KX577637.1)、USMARC-55477株(KP941586.1)各毒株的同源性依次为82.0%，99.2%，90.2%，80.7%，80.7%，90.2%，81.1%，81.3%，81.0%，80.5%，81.1%，80.5%，80.7%(图4)。同源性分析结果进一步表明，分离毒为BVDV。HB-BDZ与国内毒株HB-DCZ 株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、国外毒株Powder株(JN380089.1)的遗传距离较近，与国内毒株BJ-2013株(MH490942.1)、国外毒株1-SD1株(M96751.1)、SLO/2407/2006株(KX577637.1)、Oregon C24株(AF091605.1)(Ia亚型)遗传距离较远(图5)。分离毒HB-BDZ株与国内毒株HB-DCZ 株同属于Ib亚型。

M.DL1000 DNA Marker；1.BVDV分离株；2.Oregon C24V

图4 BVDV分离株HB-BDZ的E0基因核苷酸序列与其他毒株的同源性比较

图5 BVDV分离株HB-BDZ的系统发育进化树

2.2.2IBRV的PCR鉴定及序列分析 以 IBRV 特异性引物P3/P4为引物，扩增分离株基因组DNA，PCR 扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得约 380 bp特异性目的条带(图6)，大小与 IBRV参考株目的条带相符。PCR结果进一步表明，分离毒株HB-XTZ为IBRV。利用DNAstar软件对分离株HB-XTZ与其他参考株gB基因相应核苷酸进行同源性比较分析，其同源性分别为SZ 株(JN106446)94.1%、XE株(JN106447)94.1%、BH81 株(DQ006854)94.4%、BoHV-1-1564-11(KF584167)94.7%、IBRV-DM株(JN106443)94.1%、LD19 株(AY078725)93.8%、XT-IBRV(MF287966)100%、BH80 株(AY745877)94.1%、BHV1.1USA 株(KJ652515)94.1%、SMU6352株(MK654723)94.7%(图7)。序列同源性分析结果进一步标明，分离株为IBRV。利用DNAstar软件对HB-XTZ株与GenBank中代表毒株构建系统发育进化树，发现分离株HB-XTZ株与国内XT-IBRV(MF287966)首先集合在一起，其亲缘关系最近，与BHV1.1USA 株(KJ652515)和BH80 株(AY745877)遗传距离相对较近，而与其他毒株遗传距离较远(图8)。

M.DL1000 DNA Marker；1.IBRV分离株；2.HVRI-IBRV-004

图7 IBRV分离株gB基因核苷酸序列与其他毒株的同源性比较

图8 IBRV分离株HB-XTZ的系统发育进化树

2.3 Pm与Kp的分离培养

2.3.1Pm的分离培养结果 被检样品中有48份离出疑似Pm，将其编号为Pm1～Pm48。分离菌株在绵羊血琼脂平板培养基上生长良好，菌落呈灰白色，透明光滑，如露珠状，无溶血圈(图9A)；镜检结果为革兰阴性，菌体呈细小的短杆状或球杆状，中间微凸，两端顿圆(图9B)。其基本符合Pm的培养特征与形态特征，可初步判定其为Pm。

A.绵羊血琼脂平板培养Pm分离株；B.Pm分离株的镜检结果

2.3.2Kp的分离培养结果 被检样品中有46份分离出疑似Kp，将其编号为Kp1～Kp46。分离菌株在麦康凯培养基上生长，呈粉红色、光滑湿润的圆形菌落(图10A)。镜检结果为革兰阴性，菌体呈粗短杆状形、圆杆状，成双或短链状排列(图10B)，在西蒙氏柠檬酸盐鉴别培养基呈蓝色、光滑、边缘整齐的圆形菌落(图10C)。分离菌株基本符合Kp的培养特征与形态特征，可初步判定其为Kp。

A.麦康凯琼脂平板培养Kp分离株；B.西蒙柠檬酸盐鉴别培养Kp分离株；C.Kp分离株的镜检结果

2.4 Pm与Kp分离株的生化鉴定

2.4.1Pm分离株的生化鉴定结果 部分Pm分离菌的生化鉴定结果由表2可知，Pm分离菌的生化特性基本符合Pm的生化特性。根据分离菌的生化特性，结合其培养特性和菌体形态特征观察结果，可进一步判断分其为Pm。

表2 Pm分离菌株生化鉴定结果

2.4.2Kp分离株的生化鉴定结果 部分K p分离菌的生化鉴定结果由表3可知，Kp分离菌的生化特性基本符合Pm的生化特性。从分离菌的生化特性结合培养特性和形态特征，可进一步判断分离菌为Kp。

2.5 Pm与Kp分离株PCR鉴定与序列分析

2.5.1Pm分离株PCR鉴定与序列分析 提取Pm分离株沧州株CZ-Pm42、保定株BD-Pm28、邯郸株HD-Pm 19细菌基因组DNA，用特异性引物F1/F2扩增kmt基因,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果均出现约277 bp目的片段，与预期结果一致(图11)。序列测定结果表明，扩增kmt基因片段为686 bp，与预期长度相同。同源性分析结果显示，Pm分离株BD-Pm28、BD-Pm19、CZ-Pm42与GenBank其他参考菌株的同源性分别为96.4%～100%,95.5%～100%和96.4%～100%，3株分离菌之间的同源性为98.4%～97.6%(图12)。同源性分析结果进一步标明分离株为Pm。kmt基因系统发育分析结果表明，Pm分离株BD-Pm28、HD-Pm19、CZ-Pm42与MH068783.1的亲缘关系最近(图13)。

M.DL1000 DNA Marker，1～3.分离株CZ-Pm42、BD-Pm28、HD-Pm 19的kmt基因

图12 Pm分离株CZ-Pm42、BD-Pm28、HD-Pm19 kmt基因核苷酸同源性分析

图13 BD-Pm28、HD-Pm19、CZ-Pm24系统发育进化树

2.5.2Kp分离株PCR鉴定与序列分析 提取Kp分离株邯郸株HD-Kp21、沧州株CZ-Kp28、石家庄株SJZ-Kp34、衡水HS-Kp35Kp分离菌基因组DNA，用特异性引物F3/F4扩增phoE基因,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果均出现约441 bp目的片段，与预期结果一致(图14)。序列测定结果表明，扩增phoE基因片段为441 bp，与预期长度相同。同源性分析结果显示，Kp分离株HD-Kp21、CZ-Kp28、SJZ-Kp34、HS-Kp35与GenBank其他参考菌株的同源性分别为96.5%～97.1%,98.6%～98.8%，99.3%～99.5%和97.2%～97.6%，4株分离菌之间的同源性为96.6%～99.3%(图15)。同源性分析结果进一步表明分离株为Kp。phoE基因系统发育分析结果表明，Kp分离株HS-Kp65、CZ-Kp28、CZ-Kp34、HD-Kp21与AF064793.1的亲缘关系最近(图16)。

M.DL1000 DNA Marker；1～4.分离株HD-Kp21、CZ-Kp28、CZ-Kp34、HS-Kp35

图15 Kp分离株HS-Kp35、CZ-Kp28、SJZ-Kp34、HD-Kp21 phoE基因核苷酸同源性分析

图16 HS-Kp35、CZ-Kp28、SJZ-Kp34、HD-Kp21系统发育进化树

2.6 分离菌Pm与Kp的致病性检测结果各试验组小鼠均出现精神沉郁，倦怠，被毛粗乱呼吸急促、双目紧闭等症状。对照组小鼠正常。Kp试验组小鼠24 h后开始死亡，48 h内全部死亡，剖检可见肺脏严重充血，散在多个灰白色结节，肝脏和脾脏肿大(图17)；Pm试验组小鼠12～36 h内全部死亡，剖检可见肺脏充血、有出血点，肝脏肿大，脾脏充血严重(图18)。

A.肺脏充血、有出血点;B.脾脏充血;C.镜检革兰阴性杆菌

无菌采取死亡小鼠的肺脏、肝脏及脾脏，涂片、染色、镜检及分离培养，镜下可见革兰染色阴性短杆菌(图17，18)，培养基上生长的菌落形态基本符合Pm或Kp形态特征。

A.肺脏充血、灰白色结节;B.脾脏肿大;C.镜检结果革兰阴性杆菌

2.7 分离菌的耐药性检测结果分离菌耐药性检测结果见表4。由表4可以看出，Pm的分离株对氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星等4种抗生素敏感；对链霉素、四环素、头孢拉啶、红霉素、苯唑西林中度敏感；对青霉素、头孢呋辛、卡那霉素、复方新诺明中度耐药；对磷霉素、庆大霉素、新霉素明显耐药。Kp的分离株对氧氟沙星、阿米卡星、新霉素等3种抗生素中度敏感；对链霉素、环丙沙星、头孢拉啶、磷霉素中度耐药；对青霉素、四环素、头孢呋辛、庆大霉素、复方新诺明、卡那霉素、氟苯尼考、红霉素、苯唑西林明显耐药。

表4 分离菌耐药性检测结果

3 讨论

牛呼吸道疾病综合征是一类多病原多因素的传染性疾病，是奶牛最常见的疫病之一[9]，近年来，有关革兰阴性菌引起牛呼吸道疾病综合征的报道越来越多，特别是由多杀性巴氏杆菌及肺炎克雷伯杆菌感染引起对呼吸道疾病日益受到研究人员的关注[10]。本试验从奶牛呼吸道病临床病例采取鼻拭子样品中进行病原的分离鉴定，分离菌在形态特征、培养特性和生化特性、致病性方面与多杀性巴士杆菌及肺炎克雷伯杆菌基本一致；用分子生物学方法对分离菌Pm和Kp进行kmt基因及phoE基因扩增及序列分析，鉴定为Pm和Kp，表明该奶牛场BRDC的病原菌主要是Pm和Kp。

抗生素作为治疗药物在奶牛细菌感染引起对呼吸道疾病的控制中起了重要作用，但长期应用抗生素导致耐药性菌株产生和抗生素残留等严重问题[11]。本研究药敏试验的结果表明，Pm的分离株对氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星等4种抗生素敏感；对链霉素、四环素、头孢拉啶、红霉素、苯唑西林中度敏感；对青霉素、头孢呋辛、卡那霉素、复方新诺明中度耐药；对磷霉素、庆大霉素、新霉素明显耐药。Kp的分离株对氧氟沙星、阿米卡星、新霉素等3种抗生素中度敏感；对链霉素、环丙沙星、头孢拉啶、磷霉素中度耐药；对青霉素、四环素、头孢呋辛、庆大霉素、复方新诺明、卡那霉素、氟苯尼考、红霉素、苯唑西林明显耐药。分离菌对大部分药物不敏感，可能与当地基层长期或大量使用该类药物，使致病菌已产生耐药性有关。因此，在生产中可以选氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星、新霉素等作为由Pm和Kp引起的奶牛呼吸道病的首选药物，且应注意交替用药，按疗程投药，严禁超剂量使用，避免或减少耐药菌株的产生。及时掌握各地区奶牛乳呼吸道疾病感染细菌病原的种类及其对抗生素的敏感性，对预防及治疗奶牛呼吸道疫病具有关键作用[12]。

病毒感染也是引起牛呼吸道疾病综合征的主要原因，据报道，BVDV、IBRV是导致牛发生BRDC对主要原因[13]。BVDV是黄病毒科瘟病毒属的成员，可引起动物的流产、腹泻和呼吸系统疾病[14]。IBRV 又称牛疱疹病毒I型(bovine herpesvirus 1，BHV-1)，是疱疹病毒科疱疹病毒亚科水痘病毒属(Varicellovirus)的成员，属于α-疱疹病毒亚科[15]。IBRV 多引起上呼吸道及气管黏膜发炎，表现为呼吸困难和流鼻涕等症状，还可引起生殖道感染、结膜发炎、脑膜脑炎、流产等多种疾病，严重危害养牛业健康[16]。因此，对该病进行有效防控已经迫在眉睫。本研究自河北省7个地区的奶牛养殖场56例临床病例采样检测，分离出BVDV和IBRV，表明BVDV和IBRV 也是引起河北省牛呼吸道疾病的主要病原。

为了解河北省地方毒株的分子特征，本研究对河北分离株HB-BDZ的E0基因进行序列测定与分析，对河北分离株HB-XTZ的gB基因进行序列测定与分析。BVDV分离毒HB-BDZ株E0基因序列与GenBank参考毒株国外毒株SLO/2407/2006株(KX577637.1)、NADL株(AJ133739.1)、Powder株(JN380089.1)国内毒株GS8株(KY675205.1)、HB-DCZ 株(JX046799.1)等其他毒株的同源性为80.5%～99.2%；系统发育进化树中，分离毒株HB-BDZ与HB-DCZ 株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、国外毒株Powder株(JN380089.1)的遗传距离较近，与国内毒株HB-DCZ 株同属于Ib亚型。IBRV分离株HB-XTZ的gB基因序列与GenBank其他IBRV参考株LD19 株(AY078725)、IBRV-DM株(JN106443)、BH80 株(AY745877)、XT-IBRV(MF287966)等gB基因核苷酸同源性为93.8%～100.0%。在构建的系统发育进化树中与国内河北分离株XT-IBRV(MF287966)首先集合在一起，其亲缘关系最近，与BHV1.1USA株(KJ652515)和BH80 株(AY745877)遗传距离相对较近，而与其他毒株遗传距离较远。

综上所述，本研究通过采集河北省不同地区不同奶牛场奶牛呼吸道疾病临床病例病料，对病原进行分离鉴定，其结果表明BVDV、IBRV、Pm、KP等4种病原是引起BRDC的主要病原。同时对2种病原菌Pm、KP分离株的致病性进行了研究，并筛选出敏感药物。本研究为揭示河北省奶牛场BRDC的流行特征，实施科学有效的防制措施奠定了基础。