植物微生物组的功能及应用研究进展

郝志敏， 钱欣雨， 董金皋

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001)

植物微生物组包括通常与植物广泛相互作用的微生物群落。它们可以在植物组织内部或外部生存，进行各种有益的活动，包括抑制潜在的植物病原体和促进植物生长。植物微生物组主要包括根际微生物群落、叶际微生物群落以及内生微生物群落。不同区系的微生物群体构成复杂，其种群多样性、偏好性和丰度受寄主植物和环境的双重影响，是植物与土壤、大气交互作用的媒介。它们通过植物本体进行物质和能量交流，已经在长期共进化中形成了高度密切的共生关系[1]。植物生长过程中，积极地从周围的微生物库中招募微生物。在土壤中，植物根系除了固着植物并作为吸收水分和营养的器官以外，还为土壤微生物群落提供了独特的生态位，吸引各种微生物群落分布在根际、根系和地表[2]。根系周围直径约40 mm的土壤层被称为根际，是微生物活动的热点区域，被认为是世界上最复杂的生态系统之一。聚集于此的微生物及其相互关系统称为根际微生物组。类似于人类肠道微生物，根际微生物组被认为是植物的“第二基因组”[3]，它也是植物微生物群落中最重要的组成部分，每克含有多达1011个微生物细胞[4]，是土壤生态系统中最为活跃的构成因子，参与了土壤中各种生物学过程(如共生)和生物化学过程(如土壤酶)，对植物的生长发育和环境适应性产生重要影响。而根系分泌物如有机酸、氨基酸、脂肪酸、酚类物质、植物生长调节剂、核苷酸、糖、腐胺、甾醇和维生素会影响根系周围的微生物组成[5]，即所谓的根际效应，不同的植物种类和基因型影响根际微生物群的组成取决于根系分泌物的类型和组成。此外植物根系内部(根内圈)也被不同种类的内生细菌所定殖。植物地上部，如茎、叶、花和果实等为微生物提供了独特的环境，但内生环境和组织外表面的生态环境存在较大差异。一般来说，植物地上部微生物群落主要来源于土壤、种子和空气，它们适应植物组织上或内部的生境，同时受到土壤、环境和栽培措施等因素的影响[2]。研究表明，植物与其地上部微生物群落之间存在着很强的功能关联，内生菌和地上部微生物群落以具有促进植物生长、提高抗病性和缓解胁迫耐受性的潜力而闻名。植物内生菌包括真菌和细菌、古菌以及极少探索的病毒世界，其中对内生真菌及其代谢产物的研究较为丰富。目前从植物组织中分离的内生真菌主要包括链格孢属(Alternariaspp.)、刺盘孢属 (Colletotrichumspp.)、镰孢菌属(Fusariumspp.)、赤霉菌属 (Gibberellaspp.)、小丛壳菌属 (Glomerellaspp.)、球座菌属 (Guignardiaspp.)、小光壳属 (Leptosphaerulinaspp.)、黑孢属 (Nigrosporaspp.)、茎点霉属 (Phomaspp.)、拟茎点霉属 (Phomopsisspp.)和炭角菌属(Xylariaspp.)等[6]，分离到的内生细菌主要包括变形菌门(Proteobacteria，占 90%)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门 (Verrucomicrobia)和酸杆菌门 (Acidobacteria)[7]等。

1 植物微生物组的功能

在植物组织中发现的称为内生菌的微生物是根际微生物组的一个子集，根际微生物中有一些是对植物有益的，例如促进植物生长的根瘤菌和真菌，促进植物生长的根际或内生细菌被称为植物生长促进细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)[8-9]。

PGPR是栖居于植物根围中的一类土壤细菌，可以通过直接或间接的机制促进植物生长，如通过产生ACC脱氨酶以及生长素、赤霉素和细胞分裂素等植物激素，提高植物内源激素水平并最终重调植物体内的激素信号来影响植物生长，其中ACC脱氨酶还可以降低植物由于盐胁迫产生的过量乙烯浓度[6]。PGPR可以提高根系钾离子的吸收和钠离子的排放，从而提高植物耐盐性，例如Bacillussubtilis可以产生挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)，使拟南芥根系高亲和性钾离子转运(High-affinity K+Transporter，HKT1)基因的表达下调，限制钠离子进入根系，同时使幼苗HKT1上调，从而促进幼苗与根系之间钠离子的循环[6]。有益微生物还可以增加营养利用率，植物依赖微生物消化土壤中的氮、磷、硫，比如固氮细菌对大豆获得铵营养十分重要。还有一些细菌通过诱导植物系统抗性来调控免疫反应从而保护植物免受病原菌的侵袭。而且大部分的PGPR都可以增加植株根毛密度和根长度及根生物量，促进根毛从近根尖部位开始形成[10]。通常情况下，PGPR作为生物肥料、植物促进和生物防除方面的接种剂，在农业生产中起着重要的作用[11]。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是与植物共生的土壤真菌，其宿主范围十分广泛，可与陆地上80%以上的维管束植物形成共生关系[12]。建立共生体后，AMF可以提高植物根系对土壤水分及养分的吸收，植物的抗旱性、耐涝性、耐盐性和抗病性，加强植物抵抗高温和重金属毒害的能力，此外AMF还可以分解有毒有机物，修复污染与退化土壤等[13]。

除了真菌外，弗兰克氏菌是一类能与多种非豆科木本双子叶植物共生固氮的放线菌，它也显著促进欧洲桤木(Alnusglutinosa)幼苗根系分枝，但会显著减少根毛数量[14]。Kumar等[15]也报道了可培养的内生放线菌节杆菌属，能够在生长室和田间条件下固定N2，增溶磷酸盐并促进小麦生长。

最新研究表明，根际微生物群落还可以促进植物表型可塑性，如植物的开花时间可能受到其影响，研究发现了连接氮循环、色氨酸 (Trp)合成的植物激素IAA和开花时间的分子相互作用网络，这对研究气候变化中的植物表型和提高作物产量具有重要意义[16]。

2 植物微生物组结构的影响因素

植物与微生物以及微生物与微生物之间的多重复杂相互作用是植物相关微生物群落选择性组合的必要条件。

细菌群落间有强烈的相互作用，比如它们之间的对抗、竞争和互利共生。微生物相互作用的共同模式是营养竞争、交换，甚至相互依赖，与此同时微生物间代谢物的相互交换有利于一些物种的生长。这也能扩展到细菌与真菌间的相互作用，因为植物与丛枝菌根、真菌、固氮根瘤菌形成共生体的能力对周围微生物的群落有强烈的影响[7]。因此，群落中不同微生物间直接的协作与竞争关系能够影响群落的组成及对宿主的效应，并决定着特定条件下的微生物相互关系。Berendsen 等研究发现，植株受到病原物感染，通过调整根际微生物群落招募了一批有益菌群。这些有益菌相互合作并作为一个整体，共同参与抵抗植物病原菌并促进植株生长[17]。这一作用还通过土壤为媒介，提高后代植株在病原菌侵染下的存活概率。

在相同的环境条件和土壤中，植物基因型是影响根际微生物组结构和功能的主要因素，这表明植物可以充当其自身根际微生物组的过滤器[3]。植物遗传变异影响根系生长、结构和分泌物组成等形态特征，进而影响微生物组的组装。根系特征对微生物群落结构的强烈影响可能是由于植物碳和氮从根系释放到周围土壤的数量和质量不同造成的。根系分泌物的多种化学成分通过刺激特定微生物的生长和/或诱导或抑制在植物-微生物和微生物-微生物相互作用中具有重要作用的特定微生物的功能来富集特定微生物。与植物相关的系统发育多样的细菌类群能够拥有共同的功能，使它们可以适应植物环境[20]。在根和根际微生物组长期共同进化的自然生态系统中，植物基因型的影响更显著。鉴于根对于根际微生物具有强的选择力，植物基因型是否以品种的形式影响微生物组的组成这个问题被提出。已有研究表明，在水培系统中，使用根际微生物组中单一菌株(根际有益菌荧光假单胞菌 WCS365)筛选了大约200株自然界中的拟南芥，发现了两份材料的微生物组中假单胞菌的生长受到了抑制[21]。说明微生物组中的个别物种能够以精确的方式影响整个微生物组的结构。

此外，植物存在精确的微生物识别机制，能够接纳有益微生物，并将有害微生物拒之门外，这对植物的健康生产和全球粮食安全非常重要。 近期，丹麦奥尔胡斯大学Simona Radutoiu和Kasper R. Andersen研究组破解了豆科植物如何利用受体蛋白中的功能域区分病原微生物和共生微生物产生的分子信号[22]。该研究结合了遗传学和结构生物学手段分析了LysM受体在豆科植物识别共生菌过程中的作用，发现该类受体蛋白中的配体识别基序是受体特异性的主要决定因素。这一发现使研究人员将免疫受体重新编程为共生受体成为可能，这是将谷类作物固氮共生工程化的第一个里程碑。目前科学家们已提出对LysM受体进行逐步合理工程化所需的概念性理解，目前，科学家们已提出对LysM受体逐步合理地进行工程化所需的概念性理解，这将是实现这一宏伟目标的重要第一步[22]。在不久的未来，有望将豆科植物独特的固氮能力转移到谷类植物中，以减少对污染性商业氮肥的需求[22]。

由此可见，人工设计或选择能够吸引有益菌群的植物是可以实现的。植物育种已经通过类似特定选择策略来改良植物。然而，由于对微生物群落功能、植物与微生物相互作用机制的认识不足，以及缺乏简单的高通量筛选方法，这一方法受到了阻碍。尽管如此，选择和培育与有益微生物群有关的植物，在产生新一代微生物改良植物方面是大有可为的。

3 植物微生物组的研究方法

随着分子生物学和生物信息学技术手段的发展，基于基因组学、转录组学和蛋白组学技术揭示根际微生物组与植物的互作关系成为现代生命科学研究的热点。植物微生物组被称为植物的第二套基因组(也叫作泛基因组)[23]，在农业生产和生态环境中发挥着不可替代的作用。而随着基因测序手段的更新与进步，科学家们对微生物组的研究更加深入。通过16S rRNA基因序列推断出的土壤样品中微生物类群相对丰度的研究表明，根际微生物群落是通过两步或多步筛选过程(two-step or multiple-step selection process)形成的：植物对分布于根外土壤、根际土壤及根内的微生物群落进行逐步的选择[24]。16S rRNA基因序列的研究方法计算微生物相对丰度能够表示微生物群落的多样性及组成结构，但是相对丰度可能会掩盖微生物群落潜在的生态信息[25]，并不能反映出微生物群落的绝对丰富度。

为了克服传统测序中的局限性，Tkacz等采取了一种绝对量化的方法[25]，通过向样品中掺入嵌合细菌16S DNA来绝对定量土壤和根际的细菌16S rRNA基因。对于每个生物分类单位(OTU)，使用rrnDB数据库[26]估算16S rRNA基因拷贝数，然后采用用于定量肠道微生物组谱分析的方法[27]。随后，计算并评估(通过与单拷贝ropB基因比较)细菌类群的绝对丰度加权平均rRNA操纵子拷贝数(量化细菌丰度)。使用这种方法来量化根外土壤、根际土壤和根内微生物群落的绝对丰度[28]。该研究通过一种计算微生物绝对丰度的方法，比较了根外土壤、根际土壤及根内微生物的16S rRNA基因数扩增的差异性，阐明了根际微生物群落组装的新模型—“扩增-选择”模型。该模型表明细菌主要门在根际土壤中被显著扩增后被根系进一步筛选，形成特异的根内微生物类群。该研究结果有助于人们进一步的认识根外、根际、根内微生物的形成机制，对后续的研究提供极具意义的参考。

基于扩增子测序的多样性与群落构成研究不足以阐明微生物组的基因或功能层面的细节，因此，在可持续农业的研究中需要运用宏基因组测序去挖掘根际核心微生物分类、基因和功能信息，以揭示介导微生物与植物间相互作用的机制。与以往对根际和土壤微生物群落的研究主要基于扩增子测序的方法相比，宏基因组测序除了提供微生物的分类组成之外，还可以提供微生物群落的基因功能信息。Jin等在全球范围内对柑橘根际微生态系统进行了分类和功能特征的生物地理学研究，以更好地确定该生境的植物驱动类群及其特性[29]。该研究同时用扩增子测序和宏基因组测序研究了全球柑橘根际微生物以及相关的非根际微生物群落构成与功能。结果表明，两种方法所产生的结果高度一致。尽管目前宏基因组测序为根际微生物群落的潜在功能提供了更进一步的理解，但只有联合利用诸如宏转录组、宏蛋白质组以及代谢组等方法[30]去探究这些潜在功能基因的表达情况，才能更好地评估植物与微生物间的相互作用。

到目前为止，大多数的植物微生物组的研究，缺乏证据表明微生物组对特定植物表型的贡献。因此，Oyserman等提出了微生物组-相关植物表型(MAPs)-first方法[31]，这是一种理论和实验路线图，可以在评估微生物组分和功能之前定量提供跨物种的可变基因图谱。但某一特定的植物表型与微生物组的特定亚群相关联，就可以开发模块化的微生物组-微生物组合，该组合与宿主基因型相一致，从而为单个宿主或宿主群体提供不同但相互兼容的图谱。除了设计模块化微生物群外，还可以采取其他途径来利用微生物组对植物生长和健康的功能潜力。这些途径包括：①通过菌株改良确；②通过基因型选择或通过遗传修饰来优化宿主植物；③合生元，其中包括有益微生物菌株或联合体与特定底物的组合，这些底物选择性地刺激它们的生长、定殖等[20]。利用途径③可以在规定的时间内设计种子、根或叶的微环境，以确保引入的微生物菌株是功能性或激活特定植物表型的内生有益微生物物种[20]。

在可控的环境中，使用细菌合成群落(SynComs)是研究微生物组内及其与植物互作关系的强有力工具。该模式是通过微生物与植物表型之间的相关性以及野生型和突变体植物之间根系微生物群落的比较或网络分析获得的[32]。从分离的菌株培养开始，在无菌环境中，混合构成合成群落，并接种于特定的宿主。Syncoms为剖析一个或少量的菌株群落是如何影响植物，以及宿主基因是如何影响微生物组成提供了合适的策略[7]。Niu等构建了由7株细菌组成的玉米根系极简微生物组，明确了根系微生物组在保护玉米植株免受镰孢菌侵染中的作用。研究表明，不仅这个简化的微生物群落的组成很重要，而且每个菌株被引入植物的顺序也很重要。这些微生物组比单一组分能够更好地保护玉米根系免受镰孢菌的侵染[33]，这一结果证实并扩展了先前的认知，即微生物群落多样性和相互作用影响致病微生物的入侵。

以上方法为验证在自然土壤条件下观察到的根系微生物组装配模式、研究根部微生物组对不同环境条件下植物适应性的影响、研究微生物与微生物之间的相互作用以及微生物基因功能提供了新的思路。

4 植物微生物组的应用

目前，使用化学农药是农业病虫害防治的最主要手段，化学农药具有速度快、杀伤效果好等特点，但其也存在对环境污染大，残留时间长，对人和动物有毒害作用等缺点。而生物防治是利用自然界中一些病原物的拮抗微生物来达到对病原生物的防控。目前已经报道的具有生防作用的细菌主要有：枯草芽胞菌属(Bacillus)、放线菌属(Streptomyces)及荧光假单胞菌属(Pseudomonas)。真菌也是生防微生物中的重要类群，目前已发现的生防真菌主要包括木霉属(Trichodermaspp.)、球囊霉属 (Glomusspp.)、 非致病性镰孢菌(Fusariumspp.)等。仅使用一种生物防治剂(biological control agents，BCA)在田间显示出很高的可变性，考虑到生物防治剂是活的生物体，可能并非在所有植物生态系统中都具有生理活性[34]，因此近期研究热点集中在使用BCA的组合来提高抗植物病原体的效果。关于含有2种、3种甚至4种微生物的BCA组合的加性或协同作用的应用，最多的涉及木霉属(Trichodermaspp.)、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)和芽胞杆菌属(Bacillusspp.)[34-35]。这种协同作用的微生物群对植物的各种表型和生理特性的影响可以归因于多种PGPB间的多种机制。Rojas Solis等证明了由内生菌施式假单胞菌E25和嗜麦芽窄食单胞菌CR71产生的挥发性二甲基二硫醚(DMDS)对灰霉病病原菌菌丝生长具有较强的抑制效果[36]；解淀粉芽胞杆菌ACCC11060和棘孢木霉GDFS1009的共培养液与纯培养液相比，抗菌物质合成水平有明显地提高[37]。此外，还发现以1∶1的比例接种这两种生物的共培养物可以提高特定氨基酸的产量[37]；木霉GDFS1009和解淀粉芽胞杆菌1841的共培养物诱导了与次生代谢、真菌寄生、抗氧化剂和植物生长相关的基因表达，促进了植物的生长和对禾谷镰孢的抗性[38]；绿色木霉(TrichodermavirensGl006)和贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensisBs006)的联合应用在防治尖孢镰孢枯萎病(Physalisperuviana)中也取得了很好的效果[34]。了解微生物群落间的相互作用将有助于设计更有效的BCA联合体并利用其生防潜力进行生物防治。

5 展 望

尽管人们越来越认识到微生物组对植物生长和健康的重要性，但利用其基因组中的潜在遗传资源作为提高作物抗逆性的新策略，仍然是未来十年面临的最大挑战之一[20]。植物和微生物的代谢工程都在不断取得进展的今天[39-40]，根际微生物在生物防治方面的综合研究也在快速发展，特别是基于标准化的实验设置和模拟合成群落，已经取得了丰硕的理论成果[41]。从植物、土壤与微生物的相互作用以及微生物间的相互作用入手，研究具有协同作用的综合生物防治剂。这其中涉及的植物宿主中特定代谢物的生物合成以及微生物组如何将该代谢物分解为营养源，仍需要做更加深入的研究[42]。设计复合生防菌防治作物病害并提高作物产量的研究，将为通过取代化学农药投入来提高环境可持续性提供一条有效的途径。

本文综述了植物微生物组的定义，植物生理活动对根际微生物群落的塑造以及对其群落组成的影响，其研究方法以及应用。微生物群落在植物生长、发育、生产能力和对环境胁迫的抵抗力中起重要作用。越来越多的研究集中在解析微生物群落和寄主植物之间的关联和关系上，尽管近年来已经取得了一些进展，但是微生物和微生物群落在提高农作物生产力方面的应用仍需更多的投入。与植物有关的微生物和微生物群落的理论研究和应用研究仍然是生命科学的主要任务。今后，对于如何结合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学方法，深入了解微生物群落的组成及作用机制，如何研制稳定且高效的PGPR制剂以改善植物的生长、生产能力和抗性以及产品质量，在确保粮食安全以应对全球气候变化方面发挥的重要作用，对于绿色农业的可持续发展和生态环境的健康稳定等方面具有重要意义。