21-羟化酶缺陷症7例临床特点及基因诊断分析

韩宾宾，郑瑞芝，解一丹，袁慧娟

(河南大学人民医院/河南省人民医院 内分泌科，河南 郑州 450003)

先天性肾上腺皮质增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是类固醇激素合成过程中某种酶缺陷，引起以皮质激素合成受损为特征的一组常染色体隐性遗传性疾病。常见类型包括21-羟化酶、11β-羟化酶、17α-羟化酶等，其中以21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)最为常见，占CAH的90%以上[1]。由于CAH临床表型变异较大，基层临床医生对该病认识不足，易出现漏诊或延误诊治，错失治疗良机，且随患者年龄增长可诱发性发育、性心理、性行为等方面的诸多问题，造成其心理与行为偏差，严重影响生活质量。本研究回顾性分析于河南省人民医院就诊的7例21-OHD患者的临床和CYP21A2基因突变特点，以期提高该病的诊治水平。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性选取2017年11月至2020年6月于河南省人民医院就诊的7例21-OHD患者，其中染色体核型为46，XY 3例，46，XX 4例，年龄3 d～44岁。父母均非近亲婚配，均无家族史。诊断参考《先天性肾上腺皮质增生症21-羟化酶缺陷诊治共识》诊断标准[2]，临床均诊断为21-OHD，其中失盐型(salt-wasters，SW)2例、单纯男性化型(simple virilizing，SV)5例。本研究通过了河南省人民医院医学伦理委员会的审查(20170303)，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1生化检查及激素测定方法 全自动生化仪测定血电解质、血糖；血气分析仪测定血气；化学发光法测定黄体生成素(leuteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、雌二醇(estrogen，E2)、睾酮(testosterone，T)、孕酮(progesterone，P)、雄烯二酮(androstenedione，AND)、硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEA-S)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮质醇(cortisol，COR)；放射免疫法测定17α-羟孕酮(17α-hydoxy progesterone，17α-OHP)、血浆肾素活性(plasma renin activity，PRA)、血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)、醛固酮(aldosterone，ALD)等。

1.2.2影像学检查 盆腔彩超、肾上腺CT、垂体磁共振成像、左手正位片等。

1.2.3基因检测

1.2.3.1基因组DNA提取 收集患者外周全血标本(EDTA抗凝)备用，采用全血基因组提取试剂盒提取DNA。

1.2.3.2引物设计与合成 根据美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)中GenBank数据库的CYP21A2基因DNA参考序列，并比较CYP21A1P基因DNA参考序列，使用Primer Premier 5.0软件设计扩增CYP21A2基因全部外显子及旁侧内含子区域(见表1)。

表1 CYP21A2基因10个外显子的扩增引物序列

1.2.3.3PCR扩增与测序 引物各20 pmol，DNA模板0.2 μg，dNTP 10 nmol，MgCl225 nmol，Taq酶 2.5 U。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，重复35个循环，72 ℃延伸10 min。利用凝胶成像系统观察条带扩增，单一条带者可进行Sanger测序，所有样本均经双向测序验证。若检测到基因突变位点，尚需进一步对受检者父母行靶向变异检测以寻找和明确变异来源。此实验由郑州大学郑州普利莱医学检验所协助完成。

1.2.3.4MLPA检测与分析 采用荷兰MRC-Holland公司的SALSA MLPA kit P050试剂盒按标准操作说明对部分患者及其父母的CYP21A2基因进行检测。

1.2.3.5生物学信息分析 将所有测序结果与文献报道和GenBank数据库中已知的标准参考序列进行比对。

2 结果

2.1 临床特征如表2所示，7例患者中，SW型2例(1男，1女)，SV型5例(2男，3女)，其中外生殖器异常占85.7%(6/7)，儿童期生长加速占71.4%(5/7)，皮肤色素沉着占71.4%(5/7)，多毛占57.1%(4/7)，乳房发育占42.9%(3/7)，阴毛早现占28.6%(2/7)。例1(核型为46，XX)生后即发现阴蒂肥大，无失盐表现，查电解质正常，后因体质量不增复诊，查高钾、低钠血症，代谢性酸中毒，确诊为SW型。另有2例女性患者(例4、例7)曾因阴蒂肥大似小阴茎样，分别于4岁、20岁行“外阴整形术”。其中，例4有月经初潮，经期短，经量少，例7为原发性闭经。2例男性SV型患者(例5、例6)，均存在幼时生长过快，胡须、喉结过早显现，声音粗或低沉，皮肤粗糙，肌肉发达等男性化表现，但早年未引起重视，以婚后不育就诊。

表2 7例21-OHD患者的临床特征

2.2 实验室检查例1、例2血气分析均示代谢性酸中毒。GnRH激发试验：例3，FSH在0、30、60、90、120 min分别为0.51、2.89、3.43、4.16、4.18 IU·L-1，LH在0、30、60、90、120 min分别为<0.2、1.58、1.54、1.33、1.47 IU·L-1；例4，FSH 25.86 IU·L-1，LH 18.38 IU·L-1。例5、例6患者行精液分析提示无精症。其他内分泌激素结果详见表3。

表3 7例患者激素结果

2.3 影像学检查除1例未查外，余6例肾上腺CT均示双侧肾上腺增粗(见图1)。盆腔彩超示4例女性患者中仅1例未探及，余呈幼稚子宫；2例男性患者(例5、例6)均示双侧睾丸微石症、精囊区囊肿，其中例5曾行“双侧精索静脉高位结扎术+包皮环切术+双侧睾丸切开活检术”，病理未见(院外)，例6行“睾丸占位切开取活检术”，病理示“双侧睾丸间质细胞瘤样增生”。已查的5例垂体磁共振成像示例5垂体后异常信号影(考虑Rathke裂隙)，余未见异常。3例行左手正位片示2例存在骨龄提前(见图2)。

图1 例6腹部CT(平扫+增强)示双侧肾上腺增生，左侧肾上腺内侧支血管平滑肌脂肪瘤

图2 例3(6岁)左手正位片示骨龄提前(约13岁)

2.4 基因突变分析所有患者均检测出CYP21A2基因变异(见图3)，其中例1同时存在CYP21A2基因外显子1～7杂合缺失。共检出7种突变类型(见表4)，包括2种剪接突变(c.292+1G>A、c.293-13C/A>G)；2种错义突变(c.518T>A、c.1069C>T)；2种缺失突变(c.740delA、外显子1～7大片段缺失)；1种缺失插入突变(c.1451_1452delGGinsC)。4例行家系成员基因筛查，结果详见表4。

表4 7例21-OHD患者CYP21A2基因的测序结果

A为例1携带c.740delA纯合变异；B为例2携带c.292+1G>A杂合变异；C为例2携带c.293-13C/A>G杂合变异；D为例5携带c.293-13C>G纯合变异；E为例3携带c.518T>A纯合变异；F为例4携带c.518T>A杂合变异；G为例4携带c.1451_1452delGGinsC杂合变异；H为例6携带c.1069C>T纯合变异。

3 讨论

21-OHD是由编码21-羟化酶的CYP21A2基因突变导致的一种常染色体隐性遗传病，为CAH的最常见类型。该基因突变致酶活性丧失或降低，使通路中孕酮、17-羟孕酮不能正常转化为11-脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇，致皮质醇、醛固酮合成减少，ACTH负反馈分泌增加，肾上腺皮质增生，同时造成上述前体物质大量堆积并向雄性激素转化。CAH主要临床特征为不同程度的肾上腺皮质功能减退、性分化与发育异常、伴或不伴体液平衡紊乱。根据国外流行病学研究显示，典型21-OHD活产儿的发病率为0.07‰～0.1‰，非经典型性的发病率则更高[3-4]。

根据酶缺陷程度的不同，21-OHD可分为经典型和非经典型(nonclassical，NC)，前者又分为SW型和SV型[5-6]。SW型，多见于新生儿，常于出生后1～4周出现呕吐、腹泻、喂养困难、脱水、体质量不增、低血糖等非特异性症状就诊，女婴因外生殖器畸形易于早期识别，男婴则不易识别，常因低钠血症、高钾血症、代谢性酸中毒、自发性低血压、休克等肾上腺危象而危及生命。本研究中，例1(女婴)生后即发现阴蒂肥大，无失盐表现，例2(男婴)存在喂养困难、脱水貌、重度营养不良、生长发育落后等失盐表现，随诊中2例均存在高钾、低钠血症，代谢性酸中毒，确诊为SW型。SV型，除无失盐表现、电解质紊乱外，余同失盐型。本研究中，3例女性SV型患者中有2例出现性早熟(例3为外周性，例4为中枢性)，另1例女性患者(例7)，尽管20岁行外阴整形术，因未明确诊断，术后未能及时补充糖皮质激素，于40岁确诊，至今未婚未育，伴有严重的心理障碍。2例男性SV型患者(例5、例6)，均因“婚后不育”就诊，分别于32、33岁确诊。非经典型，症状隐匿，女性多于男性，前者往往以多毛、痤疮、脱发、月经异常、多囊卵巢、不孕症等原因就诊，后者可无症状或仅表现为不育。对于症状不典型的SV型或NC型患者，应尽早行基因检测明确诊断。

CYP21A2基因位于6p21.3，由494个氨基酸组成，与无功能的假基因CYP21A1P高度同源(二者相距30 Kb)，与编码补体的C4A及C4B基因相毗邻[7-8]。真假基因间的重排是引起21-OHD致病突变的主要分子病理基础[1,9]。迄今为止，已报道的CYP21A2基因突变类型将近300种[8,10]。众多研究已证实，CYP21A2基因突变谱和热点突变在不同群体之间存在种族差异[11-13]。在55例21-OHD的印度患者中，53例检出双等位基因突变(14例纯合突变，39例复合杂合突变)，其中c.293-13C/A>G(20%)突变最为常见，其次为c.1069C>T(14.5%)、c.518T>A(12.7%)和8-bpdel(12.7%)[12]。Wang等[13]对230例中国21-OHD患者(142例SW型、60例SV型、28例待分型)进行CYP21A2基因变异分析，发现最常见的变异位点是c.293-13C/A>G(35%)，其次为c.518T>A(14.3%)、c.1069C>T(5.9%)，与本研究结果相符。值得一提的是，大片段的缺失/转化被描述为一些地区国家检测到的最常见突变。Chi等[11]对一项来自204个家庭的212名21-OHD越南患者的队列研究显示，缺失突变(占34.48%)为CYP21A2最常见的基因突变类型，其次是c.293-13C/A>G(28.57%)、c.1069C>T(15.51%)和c.518T>A(10.59%)。同样，缺失突变在中国香港、伊拉克、伊朗、德国、奥地利等多个国家的研究中也最常见[14-16]。日本学者Koyama等[17]曾在1例SW型患者中发现c.740delA突变，并预测其会破坏正常阅读框，致P450多肽血红素结合区之前mRNA过早终止，最终导致酶活性完全丧失，本研究中也有此突变位点的报告(即例1的c.740delA纯和突变、外显子1～7杂合缺失)。因此，对于患儿基因突变阳性而父母阴性的病例，应需进一步行MLPA基因检测，以明确有无大片段基因缺失的可能。此外，c.292+1G>A突变位于内含子2经典剪切位置区域，c.1451_1452delGGinsC位于10号外显子，两者均为罕见突变，最初分别被Lee等[18]和Wedell等[19]所报道，预测与SW型21-OHD有关。

21-OHD治疗目标在于激素替代，抑制高雄激素血症，即模拟最佳生长曲线，促进第二性征发育，维持正常生殖功能和预防代谢健康问题(如高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、血脂异常、心脑血管疾病等)。其治疗方案的选择有赖于疾病分型、年龄以及有无应激反应、合并症、并发症等。糖皮质激素是此病治疗的关键，部分尚需联合盐皮质激素、性激素替代和促生长药物等综合支持治疗。值得注意的是，对于骨骺尚未闭合的患儿，宜应用氢化可的松，不宜用强的松或地塞米松治疗，以免促进骨骺闭合，影响最终身高。

总之，本研究对象临床表型均符合21-OHD，均存在CYP21A2基因突变，且以纯合突变或复合杂合突变为主，CYP21A2基因可能为21-OHD的致病基因。鉴于21-OHD临床异质性较大，尤其对于非典型患者更容易漏诊或延误诊治，联合基因检测至关重要，有助于该病的早期诊治及改善预后。