肝细胞型药物性肝损伤患者全基因组关联分析

黎莺辉 刘永萍 李东良

药物性肝损伤（DILI）是指由各类药物、保健品、生物制剂、膳食补充剂及其代谢产物乃至辅料所引发的肝损伤，是最严重和最常见的药品不良反应之一，严重者可导致肝衰竭，乃至死亡［1-3］。近年来，药物性肝损伤的发病率及致死率有逐年升高的趋势，目前DILI的发病率已经跃居肝脏疾病中的第三位［4］。DILI的发病机制复杂且个体差异大，不同个体DNA序列存在多态性，而这种多态性可能导致其对应基因的功能发生改变，从而导致DILI的发生。DILI根据受损靶细胞可分为肝细胞型、胆汁淤积型、混合型、肝血管型，其中以肝细胞型最为常见［5］，而不同分型的DILI可能发病机制有所差异。全基因组关联分析（GWAS）是利用芯片在全基因组水平上检测与疾病相关的易感位点、区域和相关基因。本研究利用Illumina SNP芯片对肝细胞型DILI患者DNA进行GWAS，以期发现与肝细胞型DILI发病有关的易感基因，进而揭示DILI的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017年1月至2019年12月本院诊断为肝细胞型DILI 30例（病例组），男14例，女16例，平均年龄为（48.6±10.62）岁。均符合《药物性肝损伤诊治指南（2015年版）》的诊断流程和要点；采用指南推荐的RUCAM评分量表对DILI患者进行评分，选取RUCAM评分≥6分的DILI患者；根据患者入院时血清谷丙转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）计算R值，即R=（血清ALT实测值/正常值上限）/（ALP实测值/正常值上限），R≥5为肝细胞型，2≤R<5为混合型，R<2为胆汁淤积型。另选择同时期体检健康者30例为对照组，男15例，女15例，平均年龄（45.8±15.64）岁。两组间均无血缘关系，无其他肝胆系统疾病，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、遗传性肝病、胆囊结石等；不伴有高血压、糖尿病、精神神经疾病等具有遗传倾向或患有遗传病；不伴有严重免疫缺陷。两组性别、年龄比较差异无统计学意义。

1.2 方法 （1）DNA抽提：所有受试者抽取EDTA抗凝静脉血3 mL保存在-20 ℃冰箱，提取血细胞DNA保存在-80 ℃冰箱［6］。（2）全基因组扫描：将提取的DNA外送上海欧易生物医学科技有限公司，由该公司按照芯片说明书完成DNA与Illumina Global Screening Array芯片杂交，获得的样本原始数据利用GenomeStudio（V2011.1，Illumina）进行分析，获取每个样本基因型数据［7］。（3）数据处理和关联分析：应用Plink（version1.9）软件过滤基因型缺失<10%，最小等位基因频率<0.01，Hardy-Weinberg平衡检测<1E-10的SNP位点，将过滤后的SNP位点进行关联分析。（4）富集分析：通过hapmap数据库进行功能注释，分别进行GO分析和KEGG分析。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 22.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，或中位数（四分位间距）表示，组间差异采用方差分析或秩和检验。组间性别比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DILI患者一般资料 DILI患者平均住院11（8~17）d；引起肝功能损害的药物有：中草药（雷公藤、决明子、柴胡、何首乌、壮骨关节丸、尿毒清）14例，西药（别嘌醇、阿托伐他汀、对乙酰氨基酚、抗结核药、秋水仙碱 ）16例，其中抗结核药（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺 ）6例；DILI患者血清学指标见表1。

表1 DILI患者入院和出院时血清学指标

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 所选取的样本经Hardy-Weinberg平衡检测P>0.05，表明样本具有代表性，所代表的群体符合遗传平衡。

2.3 数据处理和关联分析 60个样本检测出的SNP经数据过滤后得到SNP 287769个，再经关联分析后得到有统计学意义的SNP 8352个（见图1）。等位基因差异最大的SNP位点（P<0.0001）总共有16个，对应有7个基因：CTNNBIP1、LOC105376942、HLA-DQA1、IGF2R、LOC112268039、DNHD1、LACC1，其中第6号染色体上的差异SNP位点比较集中，其所对应的基因为HLA-DQA1和IGF2R（见表2）。

表2 全基因组等位基因关联分析与肝细胞型DILI有强相关的SNP

图1 等位基因关联分析曼哈顿图

2.4 富集分析 8352个SNP对应的基因总共有591个。绘制GO分析的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）显著性最小的前10个注释基因的条形图，见图2。同时绘制KEGG富集分析结果中显著性最小的前12个通路的气泡图，见图3。最后对16个差异最显著的SNP进行GO分析，结果发现差异最显著的基因为HLA-DQA1和IGF2R。见表3，表4。细胞组分分析显示这两个基因主要存在于高尔基体、细胞核、细胞内吞小泡、反式高尔基体网、网格蛋白小泡膜上；分子功能分析显示这两个基因主要参与多肽抗原连接、胰岛素样生长因子结合、鸟嘌呤核苷酸结合、胞内维甲酸结合和MHC II类受体活性。

表3 差异表达基因生物学过程GO分析结果

表4 差异表达基因细胞组分GO分析结果

图2 差异表达基因GO富集图

图3 差异表达基因KEGG富集图

3 讨论

目前DILI的诊断为排他性的诊断，诊断之前需排除其他肝脏疾病，然后根据可疑药物接触史及传统生物标志物ALT、AST、ALP［8］进行诊断，加上DILI缺乏特异性的生物标志物和典型的临床表现，因此DILI的诊断难上加难，临床上经常出现漏诊、误诊现象。目前，有1200余种药物可导致不同程度的肝损伤［9］，国外以抗菌药所致的DILI最为常见［10］，我国以抗结核药所致的DILI最为常见［11］，本研究显示，西药中导致肝细胞型DILI最常见的为抗结核药，其次为中草药。我国DILI的发病率约为92.95/10万［12］，西方国家DILI的发病率达1~20/1万［13］。据报道，多数DILI 患者的预后较好，但药物诱发引起的肝功能衰竭病死率较高，甚至发现3周内接受肝移植者生存率仅42%［14］。因此早诊断、早治疗、早预防成为降低DILI病死率的关键性因素。

目前，DILI的发病机制尚未明确。有学者认为机体免疫在DILI的发生发展中起关键作用，并提出半抗原假说和基因多态性假说。同时，部分研究机构展开了候选基因关联分析及全基因组关联分析的深度研究，并发现一些风险遗传因子，发现某些涉及药物转运、细胞应答和免疫反应的基因多态性与个体发生DILI的易感性有关［15-18］。且不同分型的DILI遗传易感性可能存在差异，有研究发现，HLA-DQB1*0602和HLA-DRB1*1501与阿莫西林克拉维酸引起的胆汁淤积型DILI有关［19］，而HLA-A*3002和HLA-B*1801与阿莫西林克拉维酸引起的肝细胞型DILI有关［20］。本研究针对肝细胞型药物性肝损伤患者进行GWAS结果显示，与肝细胞型DILI相关性最显著的基因是胰岛素样生长因子2受体（IIGF-2R）和人类白细胞抗原-DQA1（HLA-DQA1），其中HLA-DQA1基因的SNP位点rs9272780和IGF2R基因的SNP位点rs4709391与肝细胞型DILI的发病呈强相关性，且差异最显著的SNP位点主要集中在6号染色体上。

IGF2R基因定位于常染色6q26区域，全长约136kb，含有48个外显子，属I型跨膜糖蛋白［21］。近年来研究显示，IGF2R在体内、体外均可抑制细胞的生长，对于抑制细胞过度增殖和促进凋亡具有重要调节作用［22］。目前研究发现，IGF2R基因多态性与多种肿瘤的发生发展密切相关，如肝癌、胃癌、结直肠癌、肺癌等［23-25］，IGF2R被称为肿瘤的抑癌基因。且有研究发现IGF2R基因的突变可能抑制机体的免疫功能［26］，而免疫性损伤及细胞凋亡在DILI的发病机制中起重要的作用，本研究对16个差异最显著的SNP进行GO分析发现，IGF2R基因主要与生长因子、高尔基体有关，因此作者推测，IGF2R基因多态性可能与肝细胞型DILI的易感性有关。

HLA基因位于人体第6号染色体短臂上，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类3个基因区，其中Ⅱ类基因区主要包括HLA-DR、DP、DQ3个亚区，主要参与外源性抗原提呈和免疫应答，因此HLA与机体的免疫调节及免疫应答有着密切的关系。虽然DILI发病机制尚未完全明确，但目前很多研究表明HLA基因突变是导致DILI的一个独立的危险因素［27］。杨志明等［28］研究发现HLADQA1*0103等位基因可能是慢性丙型肝炎的拮抗基因，而HLA-DQA1*0501等位基因可能会抑制转氨酶升高，减慢肝功能损害的进程，最终影响疾病的转归。且也有研究［29］发现HLA-DQA1基因多态性与慢性乙型病毒性肝炎易感性有关。MENG等［30］研究发现HLADQA1*0102为抗结核药物所致肝损伤的保护因素。本研究发现HLA-DQA1基因多态性与肝细胞型药物性肝损伤易感性有关。

药物性肝损伤是与多基因相关的，是包括环境、遗传、药物等多种因素引起的复杂性肝病。IGF-2R和HLA-DQA1基因多态性可能与肝细胞型药物性肝损伤易感性有关，下一步作者将加大样本量、针对单一药物或某一类药物进行进一步验证，为DILI的发病机制提供理论依据，以及为筛查DILI的易感人群和诊断DILI提供可行的方法。