吸烟相关COPD肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症在发病中的作用机制

王辉 叶彩虹 马焕丽 孙俊生 陈斯亮 张韶斌★

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种以持续性气流受限为特征的慢性气道炎症［1］，香烟烟雾是其原发病因之一［2］，但其在COPD 发病中的具体作用机制仍需进一步研究。关于香烟烟雾暴露对下呼吸道菌群分布影响的小鼠实验表明［3］，香烟烟雾暴露可能通过加快致病菌生长速度，诱导下呼吸道菌群组成改变，引起宿主下呼吸道免疫反应，增加肺部疾病发生风险。另有学者指出［4］，吸烟可刺激支气管上皮细胞，募集中性粒细胞、巨噬细胞等天然免疫细胞，异常增殖辅助性T 细胞Th17（T helper cells-17，Th17），破坏调节性T 淋巴细胞（Regulatory T cells，Treg）/Th17平衡，降低免疫抑制功能，加重肺部炎症反应。本研究尝试探讨吸烟相关COPD 肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症之间关系及在发病中的作用机制。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2019年4月至2020年3月本院COPD 稳定期患者68 例，另选取同期肺功能正常者68 例。根据是否吸烟将COPD 稳定期患者分为吸烟COPD 组（n=20）、戒烟COPD 组（n=29）、不吸烟COPD 组（n=19）；肺功能正常者分为吸烟肺功能正常组（n=22）、戒烟肺功能正常组（n=26）、不吸烟肺功能正常组（n=20）。纳入标准：①COPD 患者均符合COPD 诊断标准［5］；②肺功能正常患者经肺功能仪检查未发现肺功能受限，且未合并其他器质性疾病；③吸烟状态定义［6］：吸烟者为截至目前使用≥100 支香烟，且≥1 次/月，目前并未戒断；戒烟者即从前吸烟者截至目前使用≥100 支香烟，但目前已戒断≥12 个月；不吸烟者为截至目前从不使用或者使用＜100 支，且目前不吸烟≥12 个月。排除标准：①近6 个月内有急性COPD 发作史者；②合并支气管哮喘、支气管扩张及其他肺部疾病者；③被动吸烟者；④精神行为异常者。本院伦理委员会经审核评议同意本研究，研究对象均知情同意。

1.2 仪器与方法

①所有研究对象均戒烟12 h，清晨空腹抽取静脉血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4℃保存备用；采集肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage，BAL）50 mL，4℃保存备用。②BAL 离心处理（500 g，4℃离心，10 min），qPCR 法提取DNA，采用454 焦磷酸法对细菌16sRNA 进行测序，后采用Quantitative Insights into Microbial Ecology 法分析16sRNA 数据，获取肺微生态菌群多样性（Chao 指数、Simpson 指数）。③采用美国贝克曼库尔特公司DxFLEX 型流式细胞仪检测外周血、BAL 中Treg 细胞与Th17细胞含量；室温条件下，2 800 r/min 离心10 min，采用瑞士帝肯公司SPARK 10M 酶标仪以上海江莱生物科技有限公司酶联免疫吸附试验试剂盒（规格：96T）测定血清和BAL 上清白细胞介素（Interleukin，IL）-17、IL-10、IL-35、IL-6 及IL-8。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 进行数据处理；计量资料以（）描述，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用n（%）表示，行χ2检验；采用Spearman 相关系数模型分析吸烟与肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症因子的关系；采用Pearson 相关系数模型分析肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症因子之间相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6 组基线资料比较

6 组第1 s 用力呼气容积（forcedexpiratory volume in one second，FEV1）占预计值百分比、FEV1与用力肺活量比值（forced vital capacity，FVC）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 6 组基线资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data of 6 groups［n（%），（±s）］

表1 6 组基线资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data of 6 groups［n（%），（±s）］

注：与不吸烟肺功能正常组比较，aP＜0.05。

组别吸烟COPD 组戒烟COPD 组不吸烟COPD 组吸烟肺功能正常组戒烟肺功能正常组不吸烟肺功能正常组F/χ2值P 值n 20 29 19 22 26 20男性12（60.00）15（51.72）10（52.63）8（36.36）11（42.31）10（50.00）3.024 0.696年龄（岁）60.49±8.27 58.76±9.41 57.35±10.64 59.23±8.61 58.57±7.62 57.19±9.84 0.366 0.871肺功能FEV1占预计值百分比（%）50.73±6.42a 56.29±8.37a 60.36±5.29a 80.24±2.83a 82.45±3.39a 83.49±5.38 149.503＜0.001 FEV1/FVC（%）41.60±6.48a 47.45±6.96a 53.49±7.37a 79.52±7.36a 80.46±6.23a 82.09±8.21a 155.373＜0.001

2.2 6 组肺微生态菌群多样性、外周血、BAL 中Treg/Th17、炎性因子比较

Chao 指数、外周血和BAL 中Treg/Th17、IL-10、IL-35 指标在各组间比较，吸烟COPD 组＜戒烟COPD组＜非吸烟COPD 组＜吸烟肺功能正常组＜戒烟肺功能正常组＜非吸烟肺功能正常组，Simpson指数在各组间比较，吸烟COPD组＞戒烟COPD组＞非吸烟COPD组＞吸烟肺功能正常组＞戒烟肺功能正常组＞非吸烟肺功能正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、表3。

表2 6 组肺微生态菌群多样性比较（±s）Table 2 Comparison of the diversity of the microflora in the lung of 6 group（±s）

表2 6 组肺微生态菌群多样性比较（±s）Table 2 Comparison of the diversity of the microflora in the lung of 6 group（±s）

注：与不吸烟肺功能正常组比较，aP＜0.05。

组别吸烟COPD 组戒烟COPD 组不吸烟COPD 组吸烟肺功能正常组戒烟肺功能正常组不吸烟肺功能正常组F 值P 值n 20 29 19 22 26 20 Simpson 指数3.86±0.83a 2.62±0.55a 1.85±0.40a 1.15±0.36a 0.73±0.19a 0.35±0.10 170.553＜0.001 Chao 指数94.49±30.89a 142.69±32.61a 185.81±49.50a 231.65±53.42a 288.44±63.69a 357.49±92.58 63.135＜0.001

表3 6 组外周血、BAL 中Treg/Th17、炎性因子比较（±s）Table 3 Comparison of treg/th17 and inflammatory factors in peripheral blood and BAL of 6 groups（±s）

表3 6 组外周血、BAL 中Treg/Th17、炎性因子比较（±s）Table 3 Comparison of treg/th17 and inflammatory factors in peripheral blood and BAL of 6 groups（±s）

注：与不吸烟肺功能正常组比较，aP＜0.05。

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2.3 吸烟与肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症因子的关系

吸烟与Chao 指数、外周血和BAL 中Treg/Th17、IL-10、IL-35 呈负相关，与Simpson 指数、外周血和BAL中IL-17、IL-6、IL-8呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 吸烟与肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症因子的关系Table 4 Relationship between smoking and pulmonary microecological flora，Treg/Th17 and inflammatory factors

2.4 肺微生态菌群、Treg/Th17、炎症因子之间相关性

Pearson 相关性分析显示，肺微生态菌群多样性、Treg/Th17、炎性之间存在良好线性相关性（P＜0.05）。见表5、6。

表5 肺微生态菌群与Treg/Th17、炎症因子之间相关性Table 5 Correlation between lung microbiota and Treg/Th17，inflammatory factors

表6 Treg/Th17 与炎症因子之间相关性Table 6 Correlation between Treg/Th17 and inflammatory factors

3 讨论

学者报道指出［7］，肺部菌群定植与COPD 肺部炎症反应、局部免疫应答等均存在一定联系。但吸烟对肺微生态菌群的影响及其在COPD 发病机制中的作用鲜有报道。本研究结果显示，吸烟COPD患者Simpson 指数升高，Chao 指数下降。Zhang等［8］研究亦发现，吸烟是影响肺微生物组变异的因素，可改变下呼吸道微生态多样性及群落结构，亦是炎症性肺疾病的重要病因。结合陈琳等［9］观点认为上述结果可能是吸烟降低气道黏膜清除能力，微生物进入下呼吸道后定植于肺部，进一步损害黏膜纤毛清除功能，增加黏液生成量，引起肺部菌群紊乱，破坏肺部防御功能，加重气道上皮损伤，识别受体，引起宿主炎症免疫反应，最终形成恶性循环。

既往研究已证实［10］，Th17/Terg 紊乱在COPD发生、发展中扮演着重要角色。在COPD 中，Th17细胞可上调IL-17、IL-浓度，诱导单核巨噬细胞、中性粒细胞大量聚集于肺部，提高弹性蛋白酶、金属蛋白酶等多种酶含量，加重肺组织损伤，诱发气道炎症，释放大量趋化因子与炎性介质，激发炎症级联反应，进一步加快COPD 病情进展；Treg 可通过释放大量IL-10、IL-35 等抗炎因子，抑制Th17 细胞免疫活性的作用，避免过度免疫炎症反应所致组织损伤加重，发挥免疫调节作用［11］。另有研究发现［12］，尼古丁作为香烟烟雾主要成分之一，可影响免疫监视功能，引起T 细胞介导的免疫应答反应。同时有学者指出［13］，吸烟影响COPD 患者肺功能康复原因可能与吸烟诱导炎性因子分泌、拮抗细胞免疫功能等因素有关。本研究结果与叶彩虹等［14］研究结果相似，考虑机制可能在于香烟烟雾会释放尼古丁类、胺类等有害物质，导致Th17细胞异常增殖与活化，促使IL-17、IL-6 水平升高，而气道炎性因子水平持续性增加，会引起气道过激炎症状态，加重气道上皮损伤，形成内源性抗原持续暴露，进而导致气道、肺组织靶向性慢性炎性反应，增加COPD 发生风险。由此推测，肺微生态失调-肺免疫紊乱-炎症浸润可能是吸烟相关COPD的发病机制。

综上所述，肺微生态菌群失衡、Treg/Th17 紊乱、炎症之间相互影响可能在吸烟相关COPD 发病机制中起着重要作用。但本研究存在一定局限性，如纳入样本量少、单中心研究，今后需扩大样本量，开展多中心研究，以进一步证实研究所得结果。