H7N9 亚型流感病毒荧光定量RT-PCR 检测方法的建立

雷宇平，图门巴雅尔，张仲萍，王 锦，宁 艳，雷 冲，胡明明，孙 杰，王治维，赵 凯，张 昱，王仲兵

（山西省动物疫病预防控制中心，山西太原 030027）

流感（influenza）是由流感病毒（influenza virus，IV）引起的人兽共患病，禽类和哺乳类动物均易感。2013 年，上海市发现首例人感染H7N9亚型IV（IV-H7N9）病例。IV-H7N9 在之后4 年内引起的感染人数与H5N1 亚型20 年内引起的感染人数相似，提示其对人类健康的威胁性较高[1]。根据农业农村部官网信息，2013 年至2017 年，我国已经发生了5 次家禽IV-H7N9 疫情，流行范围几乎遍及全国[2]。

通常来说，H5 和H7 亚型IV 属于高致病性病毒，可引起鸡群中度或重度呼吸系统疾病，死亡率较高[3]。值得注意的是，与H5N1 亚型相比，H7N9 亚型在禽类中流行较隐蔽，引起的症状缺乏不易被发觉，从而导致养殖场遭受经济损失，并威胁公众身体健康[1，4]。IV-H7N9 流行通常遵循季节规律，无患病人群年龄和性别分布差异[5]。

IV 致病性强弱受多种因素影响，对易感鸡群来说，病毒毒力和鸡群免疫水平都能影响其发病情况[6]。通常人感染IV-H7N9 是通过与患病禽类密切接触引起的。感染者可发生严重呼吸系统疾病，主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难，同时伴有天门冬氨酸转移酶、肌酸激酶和乳酸脱氢酶升高，患者也会出现严重并发症，包括急性呼吸系统衰竭、休克、急性肾损伤、淤血性心衰等。

目前，人类针对IV-H7N9 的群体免疫尚未建立，且该病毒还可在禽类以外的小鼠、貂及灵长类等动物体内高度复制，因此其具有大流行的可能性[7]。尽管IV-H7N9 可在活禽中被检出，然而其在鸡群中的致病性和传播机制尚未完全明确[8]。2017年国家卫健委组成联合督导组，对流感疫情重点省份防控工作进行督查，指出我国IV-H7N9 疫情表现出病例增多、分布地区广、散发程度高等特点，但疫情总体特点未发生改变，接触被感染禽类或暴露于活禽经营市场是人感染的重要危险因素[9]。

IV-H7N9 的免疫学检测技术主要有免疫胶体金检测和酶联免疫吸附试验（ELISA）。这两种技术操作简单，适用于病毒现场检测。IV-H7N9 的分子生物学检测方法包括RT-PCR、多重RT-PCR、基因芯片、液相芯片等。其中：多重RT-PCR 可同时检测不同亚型病毒；基因芯片和液相芯片特异性高、检测时间短，但对硬件要求高，成本相对较高；RT-PCR 具有快速、灵敏度高、特异性强的优点，且可以对样品进行定量分析，是目前在监测网络中使用最广泛的方法。

加强源头管控，早期检出IV-H7N9，是减少农场经济损失，降低公众生命健康威胁的必要手段。本研究旨在构建一种高效、准确的荧光定量RT-PCR 方法，以快速检出鸡群中的IV-H7N9，为控制病毒扩散提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 核酸样品

第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品，购自国家药品标准物质网站，货号 370050；H1、H3、H5、H9 亚型禽流感（AIV）核酸样品，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，货号分别为AIV-H1 20200617P、AIV-H3 20200617P、AIV-H5 20200212P、AIV-H9 20200210P。

1.2 试剂和仪器

RNA 提取试剂盒，购自广州维伯鑫生物科技股份有限公司；ddH2O，为美国Sigma 公司产品；dNTPs、5×buffer，购自上海生工生物工程有限公司；Hot-startTaq聚合酶、MMLV 反转录酶，购自菲鹏生物股份有限公司；高速低温离心机，购自珠海黑马医学仪器有限公司；LightCycler480 荧光PCR 仪，为瑞士罗氏公司产品；小型瞬时离心机，为美国精骐公司产品；涡旋振荡器、超微量紫外分析仪，为Quawell Technology 公司产品。

1.3 引物和探针设计

从GenBank 上下载序列（H7 序列登记号：MT498676.1、MG925503.1、MN170546.2、MN686727.1；N9 序列登记号：MG266066、MN700040、MH553128、KP416232），序列比对后，分别针对H7 和N9 片段使用Primer 5.0 软件设计1对特异性引物和TaqMan 探针。引物和探针送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 荧光定量RT-PCR 扩增

按照总RNA 提取试剂盒（柱提法）说明书要求提取第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品中病毒总RNA，再使用超微量紫外分析仪，通过检测样本在260 nm 波长的吸光度来确定所提取RNA 浓度。以RNA 为模板，使用荧光PCR 仪进行荧光定量RT-PCR 扩增。反应体系为25.0 μL：RNA 模板4.0 μL、引物及探针（F1、R1、P1、F2、R2、P2，均为10 μmol/L）各0.5 μL、dNTPs

表1 引物和探针

（10 mmol/L）1.4 μL、5×buffer 5.0 μL、Hot-startTaqpolymerase（2 U/μL）1.0 μL、MMLV Reverse Transcriptase（25 U/μL）1.0 μL、ddH2O 9.6 μL。反应程序为：42 ℃，20 min；95 ℃，10 min；94 ℃，15 s，55 ℃，30 s（收集荧光），共40 个循环。

1.5 最低检测限试验

对第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品中最低检出限参考品按照产品说明书操作，加入0.5 mL 无RNA 酶去离子水复溶后（浓度为1.7×106copies/mL），分别用无RNA 酶去离子水进行10-1～10-4（浓度为1.7×105～1.7×102copies/mL）4 个浓度梯度稀释。用荧光RT-PCR 方法对待测样品进行检测从而确定最低检测限。

1.6 重复性试验

对第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品中重复性参考品按照产品说明书操作，加入无RNA 酶去离子水稀释100 倍后，利用建立的荧光RT-PCR 反应体系重复检测H7 和N9 核酸参考品10 次，记录每次反应结果并分析。

1.7 敏感性和特异性试验

以第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品作为阴性和阳性对照，参考品恢复至室温后，按照产品说明书操作，将阴性、阳性参考品分别加入0.5 mL 无RNA 酶去离子水复溶，待液体完全澄清后作为待测样品使用。阳性参考品用于敏感性检测，阴性参考品用于特异性检测；H1、H3、H5、H9 等核酸样品，同样用于特异性检测。

1.8 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0 软件对重复性试验中的变异系数（coefficient of variance，CV）进行计算，CV ≤5%，表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 最低检测限

对4 个浓度梯度的最低检出限参考品，以本试验建立的荧光定量RT-PCR 方法分别对H7 和N9片段进行检测，结果发现H7 和N9 核酸片段最低检测限均为1.7×103copies/mL（图1～2）。

图1 H7 核酸片段最低检测限结果

图2 N9 核酸片段最低检测限结果

2.2 重复性试验

为确认所建立的荧光RT-PCR 方法能否稳定检出IV-H7N9，使用该方法分别重复检测H7 和N9核酸参考品各10 次，检测结果见图3。经计算，得出H7 和N9 核酸参考品CV 分别为0.25%和0.30%，二者均＜1%（表2），提示该方法重复性良好。

表2 重复性试验结果

图3 H7 和N9 核酸参考品重复性试验结果

2.3 敏感性和特异性试验

利用第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品作为阳性和阴性对照，检测荧光定量RTPCR 方法的灵敏度。结果（图4）显示，与阳性对照相比，该方法检测的10 个IV-H7N9 样本全部为阳性，敏感性为100%（10/10）。

图4 敏感性试验结果

利用阴性参考品检测该方法特异性的结果（图5）显示：与阳性对照相比，该方法检测的20 个阴性参考品样本全部为阴性，特异性为100%（20/20）。同时使用H1、H3、H5、H9 等核酸样品进行扩增检测的结果也均为阴性（图6）。综上，该方法具有良好的特异性。

图5 阴性标准品特异性检测结果

图6 H1、H3、H5、H9 等亚型AIV 检测结果

3 讨论

甲型IV 属于正黏病毒科，是单股负链RNA病毒，含有8 个基因片段，其自然宿主主要是禽类。除蝙蝠流感病毒以外，水生禽类体内都可检测到血凝集素（hemagglutinin，HA）H1～16 和神经酰胺酶（neuraminidase，NA）N1～9 亚型病毒。IV 从禽类传染给哺乳类的情况时有发生，部分病毒能够通过突变和重排在人群中形成传播[8]。

2013 年首次报道人感染IV-H7N9，并引起了社会、学术界广泛关注。测序分析[9]显示，该病毒来源于野生鸟类，基因组发生了重排，其HA 片段来源于欧亚分支。尽管目前并没有足够流行病学证据表明IV-H7N9 可持续在人类中传播，也不能完全排除局部发生人传人现象[7]。据中国疾病预防控制中心官方网站相关信息，2017 年发现H7N9病毒变异株，其HA 片段存在插入性突变，具有高致病性，值得引起高度警惕[10]。因此，早期诊断、快速检测IV-H7N9，及时更新病毒检测方法对于该病源头防控具有重要意义。

荧光定量RT-PCR 是在反应体系中加入荧光基团和荧光淬灭基团，随着反应进行，扩增产物不断积累，荧光信号逐渐增强，从而能够利用较少样本检测出准确量化结果，是对原有PCR 技术的一大变革[11-12]。多重实时荧光PCR，是在一个PCR 管中用多个荧光探针来区分多个扩增子，具有检测效率高、内控效果好的技术优点。本试验使用这一技术，设计针对H7 和N9 片段的特异性引物与探针，建立了能够快速、高效检测IV-H7N9 的荧光定量RT-PCR 方法。该方法特异性强、操作便捷，能够为控制流感疫情争取时间。在实际操作过程中，荧光RT-PCR 方法中TaqMan 探针对于整个反应体系至关重要。探针的杂交效率较高，但荧光淬灭难以彻底，探针水解依赖于Taq酶的外切活性，定量时易受酶活性和试剂质量影响[13-15]。本研究通过使用国家第二代人感染IV-H7N9 核酸检测试剂国家参考品以及H1、H3、H5、H9 等核酸样品检测，证实该检测方法的敏感性、特异性均为100%。

另外，禽类养殖场环境复杂以及取样过程不能保证标准化操作等原因都可能造成结果偏差。同时，检测过程中混入杂质、其他病毒基因片段以及操作过程不稳定等，也可能造成结果误读。本研究重复10 次检测，发现H7 和N9 核酸参考品CV 均小于1%，提示本方法重复性和稳定性均较好。

综上所述，本研究建立了一种荧光定量RTPCR 方法，能够快速准确、稳定检测IV-H7N9，具有高度的灵敏性和特异性。