不同布鲁氏菌血清学方法检测牛羊血清抗体的比对

李盛琼，侯 巍，莫 茜，袁东波，尹 杰，高 露，雷晓琴，阳爱国

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都 610041；2.苍溪县动物疫病预防控制中心，四川苍溪 628400）

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌属细菌感染引起的一种人兽共患传染病。动物布病主要见于羊、猪、牛、犬，主要临床表现为生殖器、胎膜发炎，以致流产、不育以及各种组织的局部病灶，给我国畜牧业造成严重经济损失（每年因布病减少幼畜105 万～140 万头）。全世界每年因人畜布病造成数十亿美元的损失[1]。

由于牲畜的自由买卖，跨区域调运，近年来布病疫情出现了一定的回升[2]，因此需要加强布病监测和流行病学调查，监视疫情变化，做好预防与诊断。布病的实验室诊断是布病研究的重点和难题。血清学诊断方法虽然存在一定的假阳性、假阴性现象，但因其操作简单、试剂易保存、生物风险小、适用性广，得以广泛应用。本研究采用试管凝集试验（SAT）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）、荧光偏振试验（FPA）3 种常规血清学检测方法，对已知感染情况的92 份牛血清、92 份羊血清进行布鲁氏菌抗体检测，并对检测结果进行分析，比较这3 种血清学检测方法的检测性能，以期为布病血清学方法的选用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测试剂 布鲁氏菌试管凝集试验抗原，购自中国兽医药品监察所；布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒，购自青岛立见诊断技术发展中心；布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，购自新疆恒利达科技发展有限公司。

1.1.2 血清样本 血清样本为本中心保存的已知感染情况的牛、羊血清，各92 份。

1.1.3 设备与耗材 96 孔酶标仪，Bio-Rad 公司产品；37 ℃恒温箱，上海福玛实验设备有限公司产品；单道微量移液器和多道微量移液器，Transferpette 公司产品；一次性移液器吸头，Axygen 公司产品；荧光偏正仪（SynergyTMH1），美国Ellie 公司产品；硼硅玻璃试管，新疆恒利达科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验方法 SAT 按照GB/T18646—2018 进行操作与判定，cELISA、FPA 按试剂操作说明书进行操作和结果判定。

1.2.2 数据处理 对检测数据采用 Excel 处理，用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析。采用假阳性率、假阴性率、一致率和Kappa 值4 种分析指标。假阳性率，即在确诊的阴性样本中，用该方法检测阳性数与确诊阴性数的百分比；假阴性率，即在确诊的阳性样本中，用该方法检测阴性数与确诊阳性数的百分比；一致率，试验判定结果与标准诊断结果相同数占总检测数的比例；Kappa 值，是一致性统计指标，Kappa 值≥0.75 说明两种方法诊断结果一致性较好，0.4 ≤Kappa 值＜0.75 说明一致性一般，Kappa 值＜0.4 说明一致性不够理想。

2 结果

2.1 牛血清样品检测

采用SAT、cELISA、FPA 对92 份已知感染情况的牛血清（47 份阳性、45 份阴性）进行检测，比较其敏感性和特异性。结果（表1）显示：通过Kappa 检验，cELISA、FPA 的Kappa 值均大于0.75，SAT 的Kappa 值小于0.75；SAT 的假阴性数为12 份，假阴性率为25.53%，cELISA 和FPA 假阳性数均为1 份，假阳性率均为2.22%。

表1 牛血清样品SAT、cELISA、FPA 血清学检测检测比较结果

2.2 羊血清样品检测

采用SAT、cELISA、FPA 对92 份已知感染情况的羊血清（13 份阳性、79 份阴性）进行检测，比较其敏感性和特异性。结果（表2）显示：3 种检测方法的Kappa 值均大于0.75。SAT 和cELISA的假阴性数均为1 份，假阳性率均为7.69%；cELISA 和FPA 的假阳性数均为1 份，假阳性率均为1.27%。

表2 羊血清样品SAT、cELISA、FPA 血清学检测检测比较结果

3 分析与讨论

实验室诊断结果可为布病临床诊断提供依据。如果因实验室诊断结果假阳性率偏高而造成误诊，那么阴性畜的误杀会造成不必要的经济损失；如果因实验室诊断结果的假阴性率偏高而造成漏诊，那么会为病原扩散和疾病蔓延提供机会，且不利于布病净化。无论是误诊还是漏诊，都会造成养殖户恐慌与经济损失，严重危害公共卫生安全。

假阳性率能反应试验方法的特异性，假阳性率越低，特异性越高。本试验对3 种血清学检测进行对比分析，发现牛羊血清的SAT 假阳性率均为0，说明该方法具有较高的特异性。假阴性率能反应试验的敏感性，假阴性率越低，敏感性越高。本试验结果显示，牛羊血清样品的SAT 检测结果假阴性率较高，说明其敏感性较低。SAT 方法简便、特异性高，因此在临床上得到广泛应用，也是我国布病确诊的常用方法[3]。但SAT 方法结果判定需要20 h 以上，况且通过肉眼观察比较浑浊度，易受人为因素干扰，因此不适于现场应用与大批量样品检测。敏感性不高是SAT 的主要缺陷，但因其具有较高的特异性，所以在几个已宣称为“无布病”国家的布病根除运动中得到了良好应用。虽然SAT不再是OIE 推荐的牛布病检测方法，但其依然被广泛应用于人类布病检测[4]。

cELISA 具有较高的特异性，可以区分自然感染和免疫[5]。本次试验结果显示，cELISA 的一致性、特异性、敏感性均有较优表现。此方法操作简便，一次可完成大量样品检测，既可作为筛选试验应用于动物群体检疫，也可作为布病确诊试验，2018年被我国纳入布病法定检测方法。相对而言，在实际检测过程中，cELISA 检测结果更为可靠[6]。

FPA 试验结果显示，其敏感性达到100%，特异性达到97%以上，表明FPA 作为筛选试验用于布病检测有较好的应用前景[7]。该方法敏感性较好，不容易造成漏检，其一致性和特异性也表现较好；整个过程在单个试管的溶液内进行，无需沉淀和洗涤，分析时间只需几分钟。FPA 与ELISA 比较，反应时间短，省去了洗板和孵育时间，但需要特定仪器进行测定，不适合基层推广。任燕斌[8]等统计分析发现，FPA 在临界值为95 mP 时，其敏感性达到100%、特异性为99.6%，认为可以把FPA检测技术作为动物布病诊断方法之一，且在田间条件下，作为动物布病的筛选试验，可以快速、准确诊断布病，避免二次抓捕动物。

经上，为了降低繁重的工作量，可以先采用价格低廉、操作比较简便的SAT 进行筛选，再用特异性较好的cELISA 或FPA 复核，进行联合诊断较为理想。