一例七彩山鸡异刺线虫感染的临床诊断及其分子生物学鉴定

黄潇航，彭佳佳，李诗艺，贺金峪，王诗晨，黄志坚，黄 瑜，殷光文

（1.福建农林大学动物科学学院，福建省动物药物工程实验室，福建福州 350002；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350013）

七彩山鸡（Phasianus colchicus）是我国饲养规模较大的特种经济禽类，具有体型大、生长快、产蛋多、抗病力强等特点[1]。半舍饲养是七彩山鸡较为常见的养殖模式，能够为山鸡提供充足的活动空间，更好地模拟野外环境，但也容易造成食源性寄生虫感染的问题。

异刺线虫是鸡及常见人工繁育雉科鸟禽常见的消化道寄生虫。国内已经报道了包括白冠长尾雉[2]、孔雀[3]等多种圈养雉科鸟类异刺线虫病的临床案例。张敏等[4]在对红腹角雉异刺线虫病临床病理研究中发现，病禽盲肠病理表现为出血严重，固有层大量单核细胞浸润，形成慢性弥漫性盲肠炎等病变，在临床上具有较大的生产危害。在临床诊断上，可通过活体虫卵形态学鉴定，但检测结果容易与鸡蛔虫卵混淆，因此需要对虫卵进行分子生物学鉴定。

本研究就一例家养七彩山鸡疑似感染寄生虫病例进行病因判定，通过临床症状观察和病理剖检，运用光学显微镜对虫体进行形态学观察后进行分子生物学鉴定，以期为该类寄生虫病的临床鉴别与诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例介绍

福建省某居民庭院饲养的七彩山鸡出现精神不振、慢性消瘦、采食量下降、腹泻等症状，起初怀疑为球虫感染，使用三字球虫粉治疗但效果不佳，随后发生死亡，后推断可能为消化道蠕虫病。

1.2 临床诊断

对死禽进行剖检，检查呼吸系统、消化系统等部位，观察肝、心等部位是否存在明显的病理形态学变化，检查食道、胃、肠等消化器官内是否有寄生虫。刮取出现明显病变部位的肠道内容物做生理盐水涂片，观察是否存在寄生虫感染。采集患病山鸡病理组织样品，使用5%的甲醛溶液浸泡固定后，送往福州都拜特生物科技公司进行苏木精-伊红染色切片（HE）的制备与观察。

1.3 分子生物学鉴定

使用DNA FAST KIT 试剂盒（美国MP Biomedicals 生物公司生产）提取目的虫体基因组，参照文献[5] 报道的线虫通用引物（NEMF1：5'-CGCAAATTACCCACTCTC-3'；S3：5'-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3'）扩增分离株18S rRNA。聚合酶链式扩增反应体系为25.0 μL：ddH2O 8.5 μL，TaqMix 酶 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL；反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 5 min。通过电泳筛选阳性条带后进行切胶回收测序，与NCBI 数据库中的生物信息进行比较。扩增条带使用胶回收试剂盒回收纯化后，送往福州铂尚生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 临床剖检

临床病理剖检发现，除肠道出现较为明显肉眼眼观病变外，肝、心等未见明显病变；对肺、肝、肠等脏器进行涂片观察，未观察到原虫；对肠道进行观察，发现直肠充血肿大（图1-A），盲肠分叉部位出现黑肿，肠壁上可观察到有虫体蠕动，盲肠内容物中有大量白小短棒状线虫（图1-B），肠内壁有线虫穿孔寄生（图1-C）。以上说明消化道线虫的寄生感染对病禽消化道造成了较为严重的损害，从而导致病禽消化系统出现问题。

图1 临床病理剖检图

2.2 虫体外观

虫体外观为白色短线状虫体，长度为0.85～1.36 cm。部分虫体在盲肠内形成盘曲状（图2-A）；在盲肠部分内容物中可观察到大量虫体，在生理盐水中活动性较强（图2-B）。光镜下可观察到虫体头端略向一侧弯曲（图2-C），头部及吻部形态粗大，食道较粗（图2-D）。雄虫尾刺细长，末梢尖锐，后有膨大部位（图2-E）；雌虫体内可观察到大量虫卵，外观为椭圆形，内部含有分化的细胞结构（图2-F）。结合病变部位和寄生虫形态学初步判断，病禽感染的消化道线虫为异刺线虫。

图2 虫体的形态特征

2.3 病理组织学观察

盲肠内可以观察到大量的嗜酸性粒细胞（黄色箭头），黏膜层可见多处上皮细胞坏死脱落，核碎裂（图3-A）；小肠病理组织切片中，固有层多见肠腺间距增宽（绿色箭头），局部可见少量淋巴细胞浸润（图3-B）。综上，病理切片结果表明线虫寄生对七彩山鸡消化道造成了较为严重的机械损伤，并伴有炎性反应。

图3 肠道病理组织切片观察结果

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 PCR 扩增产物鉴定 18S rRNA 扩增条带为750～1 000 bp，阳性条带明显。阴性对照使用高压过的蒸馏水（ddH2O）添加引物体系加样，未出现条带扩增（图4）。综上，成功扩增获得七彩山鸡异刺线虫（ZZ 株）目的片段。

图4 凝胶电泳成像图

2.4.2 序列分析与比较 ZZ 株18S rRNA 序列分析显示，长度大小为760 bp，扩增获得的18S rRNA 碱基中A、T、C、G 含量依次为26%、28%、27%、19%。通过DNAstar 7.0 分析软件与NCBI 数据库中异刺线虫等虫种的18S rRNA 序列对比发现，ZZ 株同源性与鸡异刺线虫（Heterakis gallinarum）DQ503462.1 虫株最为接近，除了存在5 个位点的碱基缺失外，其余碱基排序一致，提示18S rRNA 在异刺线虫种群遗传上的保守性。通 过NCBI 数据库的BLAST 比对发现，ZZ 株的18S rRNA 序列同源性也最接近于鸡异刺线虫DQ503462.1 虫株，其次是鸡异刺线虫MK844591.1虫株、蛔虫（Ascaridia nymphii）LC057210.1 虫株，同源性依次为99.61%、99.47%、99.08%，同时也与其他虫种具有较高的基因相似性。进化树构建与分析结果（图5）显示，分离获得的ZZ 株18S rRNA 同源性与鸡蛔虫（EF180058.1）、鸽蛔虫（LC057210.1）等尽管存在超过90%的相似性，但在进化树分支构建上却与它们形成了明显的群落间分支。ZZ 株的18S rRNA 与国内报道的鸡异刺线虫DQ503462.1、MK844591.1 虫株聚于一支。

图5 禽异刺线虫18S rRNA 进化树

3 讨论

异刺线虫会造成禽类盲肠部肿大、坏死等症状，严重寄生时虫体产生的毒素等也会导致宿主中毒，同时存在诱发组织滴虫病的可能[6]。此外，异刺线虫多量寄生造成的肠道机械性损伤还可继发细菌感染，严重危害禽类的生产性能，甚至群体健康。本次剖检发现，线虫虫体钻入寄生部位引起肠道出血等症状，临床病变提示肠炎。病理组织学观察发现，七彩山鸡异刺线虫寄生感染导致其肠道出现大量的炎性灶浸润、嗜酸性粒细胞增殖，在盲肠切片中可以观察到虫体，但在心、肝、脾、肺等部位的病理变化并不显著。这提示七彩山鸡异刺线虫感染的危害主要体现在对消化系统的损伤，这也是导致七彩山鸡死亡的主要原因。

临床研究发现，异刺线虫卵与蛔虫卵存在较高的相似度，在寄生虫知识储备不足的情况下容易发生混淆。分子生物诊断技术近年来受到动物分类学界广泛关注，其中18S、12S 等遗传区间因其序列特点而被应用于蠕虫等病原生物的种群遗传演化上。本研究在传统临床诊断基础上，进一步对分离获得的七彩山鸡消化道内线虫18S rRNA进行分子生物学鉴定，发现其与鸡源异刺线虫DQ503462.1、MK844591.1 虫株同源性较高，与鸡蛔虫等其他禽类线虫分属于不同的进化树分支。国内对禽异刺线虫的诊断案例以形态学鉴定为主，而分子鉴定和病理学研究较少。本研究在传统诊断基础上，从病理组织学、分子生物学方面综合鉴定确诊了七彩山鸡的异刺线虫感染，为该地特种禽殖提供了宝贵的异刺线虫病诊断资料。

异刺线虫感染对七彩山鸡具有较大的危害，在日常的饲养管理过程中，尤其是具有户外散养经历的种群个体，应该给予适当的驱虫预防。在国内禽类异刺线虫病临床防治上，左旋咪唑等传统驱虫药等对异刺线虫具有较好的驱杀效果[7]。在临床治疗中，除了应该考虑线虫本身造成的宿主损伤外，还应考虑对可能发生的细菌继发性感染、组织滴虫病进行同步防治。在养殖管理方面，应该形成良好的驱虫防疫观念，根据各个饲养场地的实际情况定期驱虫，加强禽舍卫生管理，减少放养、混养等。这些措施对防控该病能够起到一定的积极作用。