2019 年安徽省A 型禽流感病毒群体流行率横断面研究

刘 华，何长生，苗文萍，王 维，王 倩，王 军，周迎春，沈 艳，占松鹤，朱良强

（1.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 230091；2.兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽合肥 230036）

禽流感（avian influenza，AI）是由A 型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类传染病，最早在意大利报道发生[1]。A 型AIV 有15 种亚型可感染禽类，但高致病性AI 主要由H5和H7 亚型引起，并可感染人[2-3]。在我国，AI 多发生于春季和秋季，是国家动物疫病监测计划中重点监测的动物疫病之一。为掌握安徽省AIV 的分布和流行情况，2019 年4—6 月（春季）和10—12月（秋季），分别对安徽省家禽养殖场、活禽批发市场、农贸市场、自然村散养户及野禽栖息地开展了AIV 群体流行率横断面研究，以期为科学防控AI 提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 目标群

以安徽省境内的种禽场、商品蛋禽场、商品肉禽场等家禽养殖场，活禽批发市场和农贸市场等交易市场，以及自然村散养家禽和野禽栖息地野禽为目标群。

1.2 抽样策略和样本量

采取先抽取群体再抽取个体的两阶段抽样策略。（1）群体水平，采用估计流行率方法计算样本量。预设群体流行率（p）为15%，置信水平（CL）为95%，可接受误差（d）为5%，带入公式：N=1.962×p（1-p）/d2，计算所需场点数为193 个。采用分层随机抽样法，参考相关平台数据中各种类型场点的比例并结合实际，抽取不同类型的场点（表1）。（2）个体水平，按照发现疫病方法计算样本量。设预期个体流行率15%、置信水平95%，假设试验敏感性和特异性均为100%，带入公 式：n=[1-（1-CL）]1/D×[N'-（D-1）/2]（N'为存栏量或当日交易量，野禽为无限群，D为预期群体中的感染数量），则每个场点需采集17～19 份样品。为方便基层操作，统一为每个场点采集20 份样品。

1.3 样品采集

在每个家禽养殖场，采集20 份家禽咽喉-泄殖腔双拭子；在每个活禽交易市场和农贸市场，采集3 个档口或摊位5 份家禽双拭子，同时采集5 份环境拭子（污水沟、地面、墙面、笼具、车轮污物或宰点脱毛机等）；以自然村为流行病学单元，每个村采集不少于4 户散养家禽的双拭子共20 份；在每个野禽栖息地，采集20 份新鲜野禽粪便拭子。

1.4 实验室检测

将背景信息相同的5 份样品混合成1 份混样，用A 型AIV 荧光RT-PCR 试剂盒（深圳澳东，批号5B008、60084）进行检测，只要检出1 份混样为阳性，则该样品来源场点被定义为阳性场点。

1.5 数据分析

1.5.1 群体表观流行率 一般情况下，群体表观流行率（HAp）为检测到的阳性群占抽样研究群的比值。

1.5.2 群体真实流行率 用文献[4]的方法，对分层得到的阳性率直接进行标准化计算后，与检测试验敏感性（Se）、特异性（Sp）、群体内个体抽样数量（n）一起，带入公式HSe=1-[1-p×Se-（1-p）（1-Sp）]n和HSp=Spn，HTp=（HAp+HSp-1）/（HSe+HSp-1），计算群敏感性（HSe）、群特异性（HSp）和群体真实流行率（HTp）。

1.5.4 统计方法 用SPSS 20.0 软件，对相关数据进行卡方检验和Fisher's 确切检验。

2 结果

2.1 A 型AIV 流行率

春、秋两季A 型AIV 的HAp 分别为17.9%、12.6%，二者差异不显著（P＞0.05），标准化率分别为17.4%和12.4%（表1）。参考A 型AIV荧光RT-PCR 试剂盒的试验敏感性（Se=99.0%）和特异性（Sp=99.9%），计算得HSe=96.1%，HSp=98.0%。春、秋两季A 型AIV 的HTp 分别为16.4%（95%CI：11.2%～21.6%）、10.4%（95%CI：6.1%～14.7%）。

表1 2019 年安徽省A 型AIV 横断面研究场群抽样数量及群体流行率

2.2 空间分布

检测结果（图1）显示：春、秋两季分别在10 个地级市26 个县（区、市）、9 个地级市21 个县（区、市）检出A 型AIV 核酸阳性；全省16 个地市中，有6 个两次均检出阳性，分别是六安、马鞍山、宣城、铜陵、安庆和黄山。春、秋两季检出阳性的地级市或县（区、市）数量占对应总数的比例没有统计学差异（P＞0.05）。

图1 2019 年安徽省春秋两季A 型AIV监测场点与阳性场点分布

2.3 群间与时间分布

2.3.1 不同类型 对春、秋两季的养禽场、活禽市场、自然村散户、野禽栖息地的A 型AIV 群体阳性率，分别按群间、时间进行分组并进行两两比较，经卡方检验或Fisher's 确切检验发现：春、秋两季活禽市场与养禽场的差异均有统计学意义（P＜0.05），春、秋两季活禽市场A 型AIV流行率比（prevalence ratio，PR）分别是养禽场的2.2 倍（95%CI：1.2～4.2）、2.3 倍（95%CI：1.1～5.0）；种禽场、蛋禽场和肉禽场的群阳性率均无群间和时间上的统计学差异（P＞0.05）。活禽批发市场和农贸（零售）市场之间的群阳性率也无群间和时间上统计学差异（P＞0.05）。具体结果见表2。

表2 春秋两季A 型AIV 监测场点与阳性场点群间分布

2.3.2 不同种类 对养禽场、交易市场和散养户不同种类阳性样品分布情况进行统计，结果春、秋两季均在鸡咽喉-泄殖腔拭子样品中检出A 型AIV 核酸阳性，春季还在番鸭中检出阳性，秋季在鹅中检出阳性，两次均未在野禽粪便拭子样品中检出阳性。在活禽批发市场和农贸市场的环境拭子样品中两次均有阳性检出。按样品类型分组并进行两两比较，经卡方检验或Fisher's 确切检验发现，除秋季鹅与野禽两组差异显著外（P＜0.05），其他均差异不显著（P＞0.05）；对春、秋季各组进行两两比较发现，除春季鸡样品阳性率较高且有统计学意义外（P＜0.05），其他各组均差异不显著（P＞0.05）。与水禽和野禽相比，鸡群和活禽市场环境中的A 型AIV 流行率比没有统计学意义（PR 的95%CI 穿过1）。具体结果见表3。

表3 春秋两季A 型AIV 监测样品来源群分布

2.4 分型检测

对A 型AIV 核酸阳性样品进行H5、H7、H9亚型分型，结果H5、H7亚型均呈荧光RT-PCR阴性，H9 亚型春、秋季的HAp 分别为6.2%（12/195）、4.2%（8/191）。

3 讨论

从流行病学意义上讲，2019 年春秋季安徽省A 型AIV 群体流行率有95%的可能性在6.0%～22.0%之间。2018 年的监测结果也在这个范围之内[5]。通过多年连续监测，结合流行病学抽样方法的运用和优化，大致掌握了安徽省A 型AIV流行率范围。从2017 年H7N9 疫苗应用后，H7 亚型AIV 监测结果均呈阴性。同时，连续6 次的监测也没有检出H5 亚型AIV 阳性。A 型AIV 核酸阳性样品中，H9 亚型的比例约占1/3，另外的2/3属于哪些亚型尚未进行检测，这可以在今后工作中作深入研究。此外，对于H9 亚型阳性样品，可以与高级别实验室开展合作，探索进行基因测序和分子流行病学等方面研究。2021 年国内出现了多起H5N8 亚型AI 疫情[6]，因此需要继续开展相关监测，查明安徽省是否有存在该亚型病毒。

2019 年春秋季，安徽省活禽交易环节的A 型AIV 流行率比养殖环节的高，这与诸多研究[7-9]的结论一致，也与安徽省多年的监测结果一致，但在地理位置、春秋季节、家禽种类、家禽用途等方面没有显著差异。因此，在活禽交易市场和农贸市场较多的地方，要特别注重这些场所的防疫设施改造和生物安全管理，加强检疫监管和卫生监督，加强清洗消毒和休市制度的执行，加强转变消费习俗的宣传，推行“冰鲜上市”，防止病毒向养殖环节传播和扩散。

2019 年的监测结果与往年类似，但2019 年每次监测的场点数量减少了近一半，每个场点的抽取样品数量也因抽样策略的改变而减少。因此，从群体和个体水平都大大节省了人、财、物等监测成本。在可操作性上，基层抽样人员由于对流行率、可接受误差等专业术语理解能力有限，对每个场点选择的个体样本数量也达不到一致，因而给数据分析带来困难。本次探索性使用发现疫病的策略抽取个体，虽然结果不能用来估计个体水平的流行率，但由于统一了样本数量，既方便了前端的采样操作，又方便了后端的数据统计。

春秋季两次监测的局限性在于监测场点中自然村数量稍显不足。这一方面由于养禽业向集约化、规模化发展，散养家禽数量减少；另一方面，基层队伍待遇低、老龄化、人员少，已无法满足监测采样等防疫需求。以安徽省畜牧业大县望江县为例，截至2020 年底，全县村级防疫员数量由160 多人缩减至不足70 人。对于流行病学单元结构层次较为复杂的全省范围监测，需要建立一支稳定的、高水平的基层队伍，充分挖掘基础数据，构建科学抽样框，分层开展专项监测，以获取科学精确的监测结果，从而为动物疫病精准防控奠定基础。