云南省部分猪场病料猪圆环病毒3 型PCR 检测及克隆测序

陶 杰，张敬寒，彭俊文，刘艳丽，李枝兰，吕念词，张以芳，邹丰才，柴 俊

（1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.墨江县动物疫病预防控制中心，云南墨江 654800；3.墨江县畜牧工作站，云南墨江 654800）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）由德国科学家Tischer 于20 世纪70 年代首次从猪肾脏传代细胞中被发现，当时业界对该病原认识较浅，因而对其并未重视[1]。目前已发现的PCV 有PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4 型。PCV1 没有致病性[2]，但PCV2 具有严重致病性，可以引起多种临床症状，如断乳仔猪多系统衰竭综合征、仔猪先天性震颤、猪皮炎和肾病综合征、增生性和坏死性肺炎等[3]。2016 年Palinski 等[4]借助宏基因测序技术，从发病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出PCV3。2017 年我国首次报道发现PCV3。目前PCV3 在我国广东、山东、河北、辽宁、江西、重庆、福建、湖南等多个省市均有流行[5]。2019 年4 月，周继勇团队从患有猪呼吸道疾病、腹泻、猪皮炎与肾病综合征的猪群中发现了一种新型PCV，并将其命名为PCV4[6]。

PCV3 为单股环状DNA 病毒，无囊膜，大小约2 000 bp，直径约17～20 nm，是至今发现的所有病毒中能进行自主复制的最小哺乳动物病毒[7]。PCV3 含有3 个主要开放阅读框（ORF），即ORF1、ORF2 和ORF3。其中：ORF1 编码Rep蛋白，主要参与病毒复制[8]；ORF2 编码的Cap蛋白，可诱导机体产生特异性免疫应答[9]；而ORF3 编码蛋白的功能还没有具体研究。本研究对云南省不同地区猪场的病料进行PCV3 PCR 检测，并截取其ORF2 核苷酸序列，分析其与参考毒株间的同源性，以揭示云南省PCV3 的遗传变异情况，从而为该病诊断和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料样品 24 份病料采自于云南省建水、宣威、瑞丽以及石屏等地区不同猪场疑似PCV 感染的病猪及其所产木乃伊胎的脾脏、肺脏和淋巴结。

1.1.2 主要试剂 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、DL 2 000 DNA Marker，购自宝日生物工程有限公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2×EasyTaqSuperMix、感受态细胞DH5α、PMD19-T 载体，购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒，购自北京康润诚业生物科技有限公司（GenStar）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank 中公开发表的PCV3 基因序列，利用Oligo7 软件设计1 对引物（PCV3-F：CCCACATGCGAGGGCGTTTACC；PCV3-R：CGAGGCCGCTTCATCATCCACT）扩增ORF2 基因，扩增片段长度为895 bp。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA 提取 按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 说明书，对样品上清进行DNA 提取。

1.2.3 PCR 检测 利用PCV3 检测引物PCV3-F、PCV3-R，对上述提取的样品DNA 进行PCR 扩增。PCR 反应体系25.0 μL：2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物及DNA 各1.0 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增34 个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，将PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit 回收目的片段。

1.2.4 克隆与纯化基因鉴定 采用TA 克隆，按照宝日生物工程（大连）有限公司TaKaRa pMDTM19-T Vector Cloning Kit 和TaKaRaE.coilDH5α Competent Cells 说明书进行。使用购自GenStar 公司的质粒提取试剂盒，按照说明书从培养好的菌液中提取重组质粒进行PCR 鉴定，对产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 测序及序列分析 将菌液送至昆明硕擎生物进行测序。利用DNAstar 软件，对其中1 份阳性扩增产物（命名为YNJS-2020）测序结果与GenBank 中16 株PCV3 参考毒株（表1）进行ORF2 核苷酸序列同源性分析，并通过MEGA7.0软件绘制系统发育进化树。

表1 参考毒株信息

2 结果

2.1 PCR 扩增

对PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果在895 bp 左右位置可见清晰的特异性条带，与预期相符（图1）。

图1 PCR 扩增鉴定结果

2.2 核苷酸同源性分析

使用DNAstar 中的Megalign 软件，对YNJS-2020 测序结果与GenBank 中的16 株参考毒株进行ORF2 核苷酸序列同源性分析。结果（图2）显示：第一，YNJS-2020 与16 株参考毒株同源性为97.4%～98.9%，其中与西班牙737-8-Spain-2017毒株同源性最高，为98.9%；与安徽14-201611 毒株同源性最低，为97.4%。第二，YNJS-2020 与韩国PCK3-1702 毒株、山东2-201703 毒株、山东1-201703 毒株、泰国PB01-17 毒株的同源性相同，均为97.8%；与上海0708-2016 毒株、湖北618-2016 毒株、河南13-2016 毒株以及巴西BR-RS-6毒株、美国MO2015 毒株的同源性都为98.0%。第三，YNJS-2020 与其他毒株（IT-CO2017、GXHJ1-2017、CHN-CC2016，CHNCC2016 和HZ4-2015）的同源性都在98.0%以上。

图2 YNJS-2020 毒株与国内外参考毒株同源性分析结果

2.3 ORF2 核苷酸序列系统进化树分析

用MEGA 7.0 软件对YNJS-2020 与GenBank中16 株参考毒株的ORF2 核苷酸序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树。分析结果（图3）显示：第一，YNJS-2020 与意大利IT-CO2017、广西GXHJ1-2017、江西CHNCC2016、上海0708-2016、广东HZ4-2015、吉林CHN-CC2016 等毒株的同源性相近，形成了一个亲缘关系较近的分支；第二，YNJS-2020 与西班牙737-8-Spain-2017 毒株的同源性最高，表明这两个毒株之间的亲缘关系最近；第三，YNJS-2020 与韩国PCK3-1702 毒株、山东2-201703 毒株、山东1-201703 毒株、泰国PB01-17 毒株位于两个不同的分支，表明YNJS-2020 与这几个毒株的亲缘关系较远，而与安徽14-201611 毒株的亲缘关系最远。

图3 ORF2 核苷酸系统进化树分析结果

3 讨论

PCV 是公认的危害猪群最严重的病原之一。自2016 年美国鉴定出第一株PCV3 以后，我国各地相继发现了PCV3 的存在。本研究采集了云南省不同地区猪场的病料。被采集病料的病猪分别出现皮下水肿、皮肤不规则隆起，母猪表现体温升高，产木乃伊胎。针对有此临床症状的24 份病料进行PCV3 病原检测，发现阳性检出率达到20.8%，说明云南省猪群中存在PCV3 流行。据报道[10]，2017 年华中农业大学曾对重庆、湖南等11 个省市收集的222 份样品进行PCV3 病原检测，检出阳性77 份，阳性率为34.7%。而本研究24 份病料样品的阳性检出率为20.8%，说明云南省的PCV3 流行程度可能低于这11 个省份。

本研究对YNJS-2020 与国内外分离毒株进行ORF2 基因序列比对，发现其与西班牙737-8-Spain-2017 毒株同源性最高，表明这两个毒株之间的亲缘关系最近，因此怀疑该毒株的来源可能与国外引种有关，但要确定其具体来源较困难。YNJS-2020 与部分参考毒株位于不同分支，表明其亲缘关系较远，其中与安徽14-201611 毒株亲缘关系最远，这应引起云南省今后在PCV3 疫苗株筛选研究中的注意。

4 结论

本研究确定云南省猪群中存在PCV3 感染，且流行毒株与GenBank 里选取的国内外参考毒株同源性较高，尤其与国外毒株同源性最高，提示其来源可能与国外引种有关，但也存在一定差异。建议云南省加强PCV3 监测及其流行控制，同时在今后疫苗株筛选研究中注意毒株间的同源性。