副猪嗜血杆菌对小鼠的致病性探究及感染模型的建立

宋晓明，李佃场，林佳旭，宋 杰，王 森，张洪亮，秦晓冰，单 虎

（1.青岛农业大学动物医学院，山东省新兽药创制协同创新中心，山东青岛 266109；2.乳山市行政审批服务局，山东乳山 264500 3.即墨区畜牧业发展服务中心，山东青岛 266200）

副猪嗜血杆菌病，又称格拉塞尔氏病，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的，以猪的多发性浆膜炎、纤维素性胸膜炎、脑膜炎、腹膜炎、心包炎和关节炎等多器官病变为特征的细菌性传染病[1-2]。该病在各年龄段猪群中均有发生，断奶和保育仔猪比较易感，5～8 周龄仔猪发病率为10%～15%，发病严重的养殖场死亡率达50%以上。该病呈世界性分布，危害范围较广。目前猪群病原复杂多变，病毒与细菌多病原混合感染情况严重，HPS 作为一种主要的继发病原，给国内外养猪业带来较大经济损失[3-5]。

根据琼脂扩散（kieletein-rapp-gabriedson，KRG）血清分型方法，HPS 可分为15 种血清型[6-7]。不同地区流行的HPS 血清型不同，菌株间毒力差异较大。在我国，主要流行血清4 型、5 型、12 型和13 型菌株。因血清4 型、5 型在我国流行分布范围最广，毒力较强，因此多被选作HPS 感染模型最适菌株[8-11]。从现有研究进展来看，该菌致病机理较为复杂，因此建立一种成本低且稳定可靠的感染动物模型对于HPS 研究至关重要。

本试验对HPS 血清4 型、5 型的6 种菌株进行昆明系（KM）小鼠致病性分析，选取最适菌株最适剂量对小鼠进行腹腔注射，将死亡小鼠的临床症状、病理变化与HPS 猪体试验进行对比，然后进行细菌分离鉴定、PCR 鉴定，建立KM 小鼠感染模型。

1 材料与方法

1.1 菌株

从山东、河北、福建、广东、江西5 省分离到的6 株HPS，编号分别为SD-05、ZC-7、ND-21、BD-1、HB-08、PZ-26。经KRG 血清型鉴定，SD-05、ZC-7 和ND-21 分离菌株为血清4 型，BD-1、HB-08、PZ-26 分离菌株为血清5 型。上述菌株均由本实验室鉴定、保管和备用。

1.2 试验动物

体质量16～20 g 的KM 雌性清洁级小鼠400 只，购自青岛派特福德白鼠养殖专业合作社。经检测确认，KM 小鼠HPS 抗体均呈阴性。

1.3 材料与试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），购自英国OXOID 公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），购自Sigma 公司；新生牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；DL 1 000 DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture，购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.4 HPS 对KM 小鼠毒力测定

1.4.1 血清4 型、5 型分离株复苏培养 将HPS血清4 型（SD-05、ZC-7、ND-21）、5 型（BD-1、HB-08、PZ-26）分离株分别在添加有0.005% NAD和5%新生牛血清的TSA 固体培养基上复苏，连续传至第3 代；无菌条件下挑取单菌落至5 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养10～12 h，作为种子液；将种子液按照2%接种量接种至100 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 扩大培养10～12 h；应用平板菌落计数法进行活菌计数，再将菌液稀释成5 个梯度剂量，对KM 小鼠进行毒力测定。

1.4.2 血清4 型、5 型分离株毒力测定 对于每种分离株，选取60 只KM 小鼠开展试验。将小鼠随机分为6 组，每组10 只。前5 组为试验组，每种分离株以不同剂量对小鼠腹腔注射，0.2 mL/只；第6组为对照组，腹腔注射同等剂量PBS，观察60 h。记录小鼠死亡数，根据毒力测定结果分别选取血清4 型、5 型毒力较强菌株用于KM 小鼠攻毒试验。

1.5 KM 小鼠攻毒试验

1.5.1 血清4 型菌株 选取20 只KM 小鼠开展试验，将小鼠随机平均分为2 组（试验A 组、对照A 组）。以最适剂量对试验A 组小鼠腹腔注射1.4.2 中选出的HPS 血清4 型菌株，0.2 mL/只，对照A 组腹腔注射同等剂量PBS。

1.5.2 血清5 型菌株 选取20 只KM 小鼠开展试验，将小鼠随机平均分为2 组（试验B 组、对照B 组）。以最适剂量对试验B 组小鼠腹腔注射1.4.2 中选出的HPS 血清5 型菌株，0.2 mL/只，对照B 组腹腔注射同等剂量PBS。

1.6 病理变化

观察记录感染后小鼠的临床变化，当试验组小鼠死亡后，进行病理剖检，观察主要器官病理变化情况。

1.7 细菌学鉴定

无菌条件下采集死亡小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、心血、腹腔积液、胸腔积液等组织病料，接种于添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSA、TSB 培养基中，37 ℃培养24～48 h，挑取疑似单菌落，进一步纯化培养。

1.8 PCR 鉴定

根据GenBank 中HPS 16s rRNA 基因序列（登录号：M75065）设计引物（上游引物：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游引物：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3'）。预计扩增目的片段大小为822 bp，引物送北京赛百盛基因技术有限公司合成。采用25.0 µL PCR 反应体系（表1）。反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，循环30 次；终延伸72 ℃ 10 min。根据文献[12]方法对分离菌株进行PCR 鉴定。

表1 PCR 反应体系 单位：µL

2 结果

2.1 不同分离菌株对KM 小鼠毒力测定

2.1.1 血清4 型分离菌株毒力测定 从表2～4 可以看出，尽管3 个菌株均为血清4 型，但使用不同菌株注射小鼠后，小鼠死亡情况不同。当腹腔注射剂量达到（1.1～1.3）×1010CFU 时，SD-05 株可使小鼠在48 h 内全部死亡，ZC-7 株可使80%小鼠死亡，而ND-21 株毒力最弱，只能使60%小鼠死亡。因此推测血清4 型SD-05 株毒力较强。

表2 血清4 型分离菌株SD-05 对KM 小鼠毒力测定结果

表3 血清4 型分离菌株ZC-7 对KM 小鼠毒力测定结果

表4 血清4 型分离菌株ND-21 对KM 小鼠毒力测定结果

2.1.2 血清5 型分离菌株毒力测定 从表5～7 可以看出，尽管3 个菌株均为血清5 型，但使用不同菌株注射小鼠后，小鼠死亡情况不同。当腹腔注射剂量达到（1.1～1.2）×1010CFU 时，HB-08 株可使小鼠在48 h 内全部死亡，PZ-26 株可使80%小鼠死亡，而BD-1 株只能使50%小鼠死亡。因此推测血清5 型HB-08 株毒力较强。

表5 血清5 型分离菌株BD-1 对KM 小鼠毒力测定结果

表6 血清5 型分离菌株HB-08 对KM 小鼠毒力测定结果

表7 血清5 型分离菌株PZ-26 对KM 小鼠毒力测定结果

2.2 攻毒后临床表现

为保证建立的小鼠感染模型中同时有发病病例和死亡病例，分别使用1.2×109CFU 剂量的血清4 型SD-05 株、1.175×109CFU 剂量的血清5型HB-08 株对小鼠开展攻毒试验。3 h 后，试验A、B 两组小鼠开始出现颤抖、呼吸急促、精神不振、萎靡厌食、拥挤扎堆、背毛凌乱站立等临床症状；24 h 后小鼠开始死亡，持续至攻毒60 h 后不再出现新增死亡小鼠。对照A、B 组小鼠均表现正常。

2.3 剖检变化

试验A、B 组小鼠死亡后的剖检观察发现，死亡小鼠心脏、肺脏出血，脾脏出血、肿大，肝脏有出血点、肿大，胸腔积液，肠道肿大、透明（图1）。

图1 HPS 攻毒60 h 后小鼠剖检变化

2.4 PCR 鉴定

经PCR 扩增，成功鉴定到长度约822 bp 的HPS 目的条带（图2），与预期片段大小一致。

图2 死亡小鼠组织样品PCR 鉴定结果

3 分析与讨论

HPS 常发生于饲养环境差的小型养猪场，给养殖户造成了巨大经济损失。国内外学者对HPS致病性、毒力和免疫原性的研究从未停止。猪是研究HPS 最好的试验动物模型，但普通猪常存在母源抗体影响。为避免这种情况，研究人员采用SPF 猪、初乳缺乏猪[13]、剖腹产初乳缺乏猪[14]、普通断奶仔猪等作为HPS 感染试验动物，成功复制了典型HPS 病例。SPF 猪等虽然可以作为理想的HPS 动物模型，但存在试验条件要求较高、成本高等问题，导致其在实际研究应用中存在局限性。当HPS 致病性研究需要大量试验动物时，寻求猪的替代感染动物显得尤为重要，如小鼠和豚鼠等。

本试验以HPS 血清4 型（SD-05、ZC-7、ND-21）、5 型（BD-1、HB-08、PZ-26）分离株为研究对象，对KM 小鼠进行毒力测定。结果显示：6种分离株均对小鼠有一定致病性，但不同血清型菌株以及相同血清型不同菌株，对KM 小鼠毒力及致病性也不同。其中，血清4 型SD-05 株和血清5型HB-08 株毒力较强，小鼠发病及死亡率较高，具有更强的致病性。

综合毒力测定结果，选择毒力和致病性较强、遗传特性稳定的血清4 型分离菌株SD-05 和血清5型分离菌株HB-08 作为建立HPS 血清4 型、5 型KM 小鼠感染模型的感染菌种。KM 小鼠攻毒试验中，采用SD-05株和HB-08株对小鼠进行腹腔接种，对死亡小鼠的临床症状表现、剖检变化及细菌分离鉴定结果进行分析总结。攻毒后小鼠出现颤抖、呼吸急促、精神萎靡、厌食消瘦、拥挤扎堆、背毛凌乱等情况，与猪格拉塞尔氏病具有相似临床症状；剖检发现肺脏出血及炎性变化、胸腔积液、心脏病变且伴有血凝块、胸腔轻微黏连、肝脏肿大等情况，与猪格拉塞尔氏病具有相似病理变化；通过细菌分离培养，在小鼠组织器官中分离得到HPS 菌株。研究表明，HPS 对KM 小鼠具有致病性，4 型、5型菌株不仅能够引起小鼠发病死亡，且毒力较强。综上，本试验初步建立了血清4 型、5 型副猪嗜血杆菌的小鼠感染模型，可用于研究HPS 毒力和免疫原性相关因子，为HPS研究发展奠定了应用基础。