猪德尔塔冠状病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用

赵 平，秦毅斌，何 颖，卢冰霞，刘 芳，陈 樱，韦祖樟，黄伟坚，赵 武，欧阳康

（1.广西大学，广西南宁 530005；2.广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV），又名猪丁型冠状病毒，属尼多目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科（Coronavirinae）冠状病毒属成员，是一种有囊膜的单股正链RNA 病毒，基因组全长约25.4 kb[1]。PDCoV 引发的猪肠道疾病，在临床症状上与猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）及传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的症状相似，可引起仔猪水样腹泻、呕吐等症状，严重的可导致仔猪死亡，也可引起母猪呕吐、水样腹泻、食欲下降等症状[2-3]。

2012 年Woo 等[4]从我国香港地区猪腹泻样品中首次检测到PDCoV；2013—2014 年，Dong 等[5]从国内部分省市养猪场搜集粪便样本进行PDCoV检测，发现阳性率达14.3%，证实我国内地存在PDCoV；2012—2015 年Song 等[6]在江西省采集的356 份临床样本中，检测发现PDCoV 阳性率高达33.71%。2014 年初，由PDCoV 感染所引起的猪腹泻病在美国俄亥俄州猪场暴发，其致病毒株与我国香港地区发现的PDCoV 基因组序列相似度高达99%[7]。随后美国、加拿大、泰国和韩国等国家也相继从临床样本中检测到PDCoV[8-10]。

针对PDCoV 导致的肠道性疾病，目前尚无预防疫苗和特效治疗药物。因此，建立特异性的检测方法进行准确、快速诊断，完善监测体系，对PDCoV 感染的防控具有重要意义[11]。

目前用于检测PDCoV 的RT-PCR、免疫组织化学分析和间接ELISA 等方法均已建立，但这些方法操作繁琐，耗时长，工作量较大，容易造成污染。本研究建立的荧光RT-RAA 方法具有敏感、特异、耗时短、操作简便等优点，适合临床快速检测。

1 材料和方法

1.1 材料

PDCoV、PEDV、TGEV 等病毒的阳性样品，由广西壮族自治区兽医研究所病毒室采集并保存；RNA 提取试剂盒，购于深圳真瑞生物科技有限公司；Plasmid Mini Kit 质粒小提试剂盒、胶回收DNA 纯化试剂盒，购于广州飞扬生物工程有限公司；pMD18-T 载体，购于宝生物工程（大连）有限公司；DH5α 感受态细胞，购自北京全式金生物有限公司；众测RT-RAA 核酸扩增试剂（荧光型）试剂盒，购于杭州众测生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探针和引物设计 根据PDCoV（GenBank登录号MN025260）N基因保守序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物（表1）。

表1 用于扩增PDCoV 基因组的引物

1.2.2 病毒基因组核酸提取 病毒RNA 提取按照试剂盒说明书操作。从临床样本中提取RNA，置于-80 ℃保存备用。

1.2.3 重组质粒标准品构建与鉴定 以提取的病毒RNA 为模板，使用引物进行RT-PCR 扩增，将扩增的目的片段纯化后连接pMD18-T 载体；重组质粒经测序鉴定，序列正确后，作为荧光RT-RAA的质粒标准品。

1.2.4 反应体系建立 按照RT-RAA 荧光反应试剂盒使用说明操作。在反应管中加入反应缓冲液25.0 µL，正向和反向引物（10 μmol/L）各2.1 µL，探针（10 μmol/L）0.6 µL，模板1.0 μL，加双蒸水16.7 μL 至47.5 μL，混合均匀；向每个反应单元的管盖内侧，加入2.5 μL 乙酸镁溶液并混匀；将上述反应管放置于QuantStudio 5 仪器中。反应条件：39 ℃，30 min，每隔15 s 采集1 次荧光信号。

1.2.5 引物筛选 用设计的引物和探针，分别对PDCoV-N基因核酸进行荧光RT-RAA 扩增，以确定最佳引物。

1.2.6 反应条件优化 采用筛选的引物和探针，将其浓度依次配置为1、5、10、20、50 μmol/L。选取质粒标准品为模板，在引物、探针不同浓度条件下进行荧光RT-RAA 扩增，以确定引物和探针的最佳反应浓度。确定引物和探针的最佳浓度后，选取质粒标准品作为模板，在不同温度（37、39、41 ℃）条件下进行荧光RT-RAA 扩增，以确定最佳反应温度。

1.2.7 特异性试验 按照核酸提取试剂盒说明，提取猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪轮状病毒（PROV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒（PCV2、PCV3）、猪瘟病毒（CSFV）、猪捷申病毒（PTV）以及TGEV、PEDV 等猪源病毒核酸，选取PDCoV 质粒标准品作为阳性对照，对提取的核酸用建立的PDCoV 荧光RT-RAA 方法进行扩增，设ddH2O 为阴性对照，评估该方法的特异性。

1.2.8 敏感性试验 以构建的质粒标准品为模板，按10 倍梯度依次稀释为1010～101copies/μL 后，将其作为阳性标准品备用；以不同拷贝数的阳性质粒分别作为模板，用建立的PDCoV 荧光RT-RAA 方法进行扩增，设ddH2O 为阴性对照，确定该方法的敏感性。

1.2.9 临床样品检测 利用广西兽医研究所的68份猪源病毒样品进行临床应用评价。使用RNA 提取试剂盒提取临床样本RNA，采用荧光RT-RAA方法和RT-PCR 方法对每份样本核酸进行同步检测，比较两种检测方法的敏感性。其中，RT-PCR方法反应体系：ddH2O 8.5 µL，2×Bench TopTMTaqMaster Mix 12.5 µL，上下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL。混合离心后放入PCR 仪中，并设置反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃50 s，40 个循环；72 ℃ 10 min。用建立的PDCoV荧光RT-RAA 方法对临床样本进行扩增，根据众测生物科技有限公司RT-RAA 核酸扩增试剂结果判定方法，Ct ≤30 判定为阳性，Ct ＞30 判定为阴性。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

引物筛选结果（图1）显示：第2 组引物探针（F1R2）在扩增时最先检测到荧光信号，且荧光信号强，扩增时间短，扩增效果最好，因此选择第2 组F1R2 引物、探针用于后续试验。

图1 荧光RT-RAA 不同PDCoV 引物扩增结果

2.2 反应条件优化

当引物和探针浓度均为10 µmol/L 时，荧光信号最强，扩增曲线出现得最早，因此将其确定为最佳工作浓度（图2）。当反应温度为39 ℃时，最早检测到荧光信号，且反应时间最短，因此将其设为最佳反应温度（图3）。

图2 荧光RT-RAA 不同引物浓度扩增结果

图3 荧光RT-RAA 在不同温度下的扩增PDCoV 结果

2.3 特异性试验

试验结果（图4）显示，只有PDCoV 质粒DNA 出现扩增曲线，为阳性结果，其他样本及阴性对照均没有明显扩增，均为阴性，表明本研究建立的PDCoV荧光RT-RAA检测方法具有良好的特异性。

图4 荧光RT-RAA 方法特异性试验结果

2.4 敏感性检测

以不同拷贝数的阳性质粒分别作为模板，以建立的PDCoV 荧光RT-RAA 方法进行扩增，检测结果如图5 所示。扩增的起峰时间随着拷贝数降低逐渐延长，峰值高度也随着拷贝数降低而降低，最低检出限可达101copies/μL，说明荧光RT-RAA 检测法具有较高的敏感性。

图5 荧光RT-RAA 扩增不同拷贝数PDCoV 重组质粒结果

2.5 临床样品检测与评价

临床样品结果（表2）显示：荧光RT-RAA方法的阳性检出率为17.6%，而RT-PCR 方法为13.2%，表明本研究建立的荧光RT-RAA 检测法敏感性高于RT-PCR 法。

表2 临床样品检测结果

3 讨论

PDCoV 对我国生猪养殖业造成了严重威胁，给养殖户造成了严重经济损失。目前，该病毒在国内的感染率仅次于PEDV[11]，而其导致的临床症状又与PEDV、TGEV 相似，再加上存在混合感染[12]，更增加了防治PDCoV 感染的困难。因此，建立一种快速检测PDCoV 的方法十分重要。目前没有针对PDCoV 的商品化疫苗和治疗药物，因而快速、准确诊断，尽早发现并处理染病猪，是防控PDCoV流行的重要和有效手段[13]。

目前，抗原检测包括常规RT-PCR、巢式RTPCR、荧光定量RT-PCR、免疫细胞化学分析、高通量测序等，而抗体检测主要是间接ELISA 法[14]。但是这些方法需要使用复杂的仪器和设施齐全的实验室，还需要实验人员花费时间探索稳定反应体系，且反应时间偏长。而临床快速检测需要便携、操作简单而且耗时短的检测方法。相较于抗原、抗体诊断这类传统检测技术，荧光RT-RAA 方法具有快速、灵敏、操作简单、周期短等优点。

本研究建立了一种可用于PDCoV 检测的荧光RT-RAA 方法。在对荧光RT-RAA 最适反应条件的摸索过程中发现，39 ℃时扩增曲线出现最早，反应时间最短，因而最佳反应温度确定为39 ℃；当引物和探针浓度均为10 µmol/L 时，荧光信号最强，扩增曲线出现最早，因而最佳工作浓度确定为10 µmol/L。该方法在39 ℃恒温下30 min 内即可完成检测，最低检测限为101copies/μL，且与其他猪源病毒无明显扩增。采用该方法检测68 份临床样品，发现荧光RT-RAA 敏感性率高于RT-PCR方法。

本研究建立的这种检测PDCoV 的荧光RTRAA 检测方法特异性强，灵敏度高，操作简单，反应速度快，这为今后PDCoV 快速检测提供了有效方法。