部分商品化非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒的比对

崔基贤，南文龙，高 原，兰德松，于本良，顾贵波

（1.辽宁省农业发展服务中心，辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.辽宁省农业发展服务中心农村能源环保事业部，辽宁沈阳 110034）

自2018 年8 月以来，非洲猪瘟（African swine fever，ASF）对我国生猪养殖业造成了巨大冲击，严重影响了生猪产业持续健康发展，并进一步威胁到我国动物源性蛋白的稳定供给。目前，对ASF 防控尚无可用的有效商品化疫苗和防治药物[1]，因而非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的早期发现成为防控ASF 的重要手段之一。ASFV 的早期发现离不开实验室检测的支撑。荧光PCR 方法是当前主流的ASF 检测方法。2019 年6月，中国动物疫病预防控制中心公布了可允许使用的28 个厂家生产的ASFV 荧光PCR 检测试剂名单，但目前尚未见相关检测试剂敏感性、特异性、一致性、最低检测限等评价指标的数据报道。本研究以ASFV 阳性核酸标准品和已灭活的田间样品为检测对象，以世界动物卫生组织（OIE）推荐的引物探针为金标准，初步评价了其中17 个厂家生产的ASFV 荧光PCR 检测试剂的敏感性和特异性，获得了相关诊断试验特性方面的数据，以期为ASFV荧光PCR 检测试剂选用和ASF 防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

OIE 推荐的ASFV 荧光PCR 引物探针，由中国动物卫生与流行病学中心提供；17 种商品化ASFV 荧光PCR 检测试剂盒，分别来自17 个生产厂家（16 个国产、1 个进口，依次标注为A—Q）；阳性标准物质ASFVP72基因核酸标准物质（质粒浓度5.9×103拷贝/μL），由中国动物疫病预防控制中心提供；已灭活处理的62 份ASFV 阳性田间样品，来自中国动物卫生与流行病学中心非洲猪瘟参考实验室；32 份阴性田间样品，为本实验室保存的日常监测样品。荧光PCR 仪，ABI 7500 fast；96 通道核酸提取仪，Thermo scientific KINGFISHER FLEX；96 孔核酸提取试剂盒，购自长春志昂生物科技有限公司。

1.2 敏感性和特异性评价

以中国动物卫生与流行病学中心非洲猪瘟参考实验室提供的OIE 推荐ASFV 荧光PCR 引物探针检测结果为金标准，以94 份已灭活田间样品为检测对象，分别评价17 种商品化试剂的敏感性（sensitivity，Se）和特异性（specificity，Sp），将检测结果统计为四格表（2×2）形式，分别计算17 种商品化试剂盒的Se 和Sp（表1）。计算公式[2]如下：

表1 诊断资料2×2 四格表

1.3 一致性评价

以Kappa 统计量检验各商品化试剂盒与中国动物卫生与流行病学中心非洲猪瘟参考实验室提供的荧光PCR 试剂的一致性，分别计算Kappa 值及其95%CI[2]。0.4 ≥Kappa 值＞0，说明一致性不好；Kappa 值≥0.75，说明一致性较好；0.4 ＜Kappa值＜0.75，说明一致性一般[2]。

1.4 最低检测限

将ASFV 阳性标准物质进行倍比稀释，浓度依次为5.9×103×20～5.9×103×2-7拷贝/μL，共8个倍比稀释度。分别采用17 个生产厂家的ASFV荧光PCR 商品化试剂盒进行检测，获得每种试剂盒的最低检测限。

1.5 数据分析

将检测结果等数据录入Microsoft Office 2010 Excel 软件进行整理、保存和分析，应用SPSS 22.0软件进行Kappa 检验。

2 结果

2.1 敏感性和特异性评价

以OIE 推荐引物探针为金标准进行评价。结果（表2）显示：17 个厂家试剂盒的敏感性、特异性均未达到100%。敏感性最低为77.4%，95%CI=67.0%～87.8%（厂家F），最高为96.8%，95%CI=92.4%～100%（厂家C 和P）；特异性最低为87.5%，95%CI=76.0%～99.0%（厂家A、B、G、P），最高为96.9%，95% CI=90.9%～100%（厂家F和M）。

表2 17 个厂家ASFV 荧光PCR 检测试剂盒敏感性和特异性评价结果

2.2 一致性评价

17 个厂家的试剂盒与OIE 推荐引物探针检测结果的一致性指标见表2。有12 个厂家的试剂盒与OIE 推荐引物探针检测结果一致性较好（Kappa值≥0.75），5 个厂家的试剂盒与OIE 推荐引物探针检测结果一致性一般（0.4 ＜Kappa 值＜0.75）。

2.3 最低检测限

OIE 推荐的引物探针和17 个商品化试剂盒的最低检测限结果（CT 值）统计见表3。17 个厂家的商品化试剂盒均可检测到最低稀释度为5.9×103×2-3拷贝/μL，但不同厂家试剂盒的最低检测限有所差别，5 个试剂盒可检测到的最低稀释度为5.9×103×2-3拷贝/μL，2 个试剂盒为5.9×103×2-4拷贝/μL，6 个试剂盒为5.9×103×2-5拷贝/μL，3 个试剂盒为5.9×103×2-6拷贝/μL，1 个试剂盒至少为5.9×103×2-7，且大部分国产试剂盒最低检测限均低于进口试剂盒。

表3 不同厂家试剂盒检测阳性核酸标准品最低检测限

3 讨论

ASFV 自2018 年在我国首次被发现以来，短时间内即传播到国内大部分地区，对我国生猪产业造成了沉重打击，产生了巨大的社会和经济影响。由于尚无有效的商品化疫苗可用，当前ASF 防控主要依赖严格的生物安全措施和早期发现后的精准、快速清除，而实验室检测是ASF 早期快速发现的关键措施之一。当前基于核酸水平的检测技术是 ASFV 病原检测的主要手段，尤其是荧光PCR方法，在我国被广泛应用。荧光定量PCR 方法自动化程度高且不易污染样本和环境，而商品化试剂盒将荧光定量PCR 所需的试剂整合在一起，操作更加简便，是ASFV 检测和实验室比对的指定方法[3]。

2019 年6 月以来，中国动物疫病预防控制中心共公布了可允许使用的28 个厂家生产的ASFV荧光PCR 检测试剂名单，为ASF 防控实践提供了较为可靠的技术支持。周志刚等[4]采用4 种商品化ASFV 实时荧光PCR 检测试剂盒，以ASFV 阳性对照为样品进行试验，研究了S 形曲线轮廓的一致性、曲线美观度、相对荧光强度和所需反应时间等数据；王晶等[5]同时选用《非洲猪瘟检疫技术规范》（SNT 1559—2010）中的普通PCR 方法、荧光定量 PCR 方法以及商品化试剂盒，对5 份验证样品开展ASFV 核酸检测和结果比对，发现3 种检测方法结果一致，样品检测结果与预期一致。上述研究确认了实验室现有检测方法能够满足ASFV核酸日常检测需求。但目前尚未见对ASFV 商品化荧光PCR 试剂盒敏感性、特异性等诊断特性方面的数据报道。

敏感性和特异性是诊断试验准确性方面的两个基本特性，是诊断试验研究评价中颇为稳定的指标[5]。诊断试验的敏感性越高，代表患病动物被正确检测为阳性结果的概率越高，假阴性结果比例越少；诊断试验的特异性越高，代表未患病动物被正确检测为阴性结果的概率越高，假阳性结果比例越少。评估ASFV 商品化试剂盒的敏感性和特异性，对于指导ASF 防控实践具有重大意义。采用敏感性和特异性较高的试剂盒，可减少假阴性和假阳性结果的比例，提高疫病早期发现的概率并减少依据假阳性结果处理造成的损失。本研究以OIE 推荐的荧光PCR 引物探针为金标准，初步评价了17 个厂家生产的商品化ASFV 荧光PCR 试剂盒的敏感性和特异性。本研究结果显示，17 个厂家商品化试剂盒的敏感性最低为77.4%，最高为96.8%，特异性最低为87.5%，最高为96.8%，均未到100%，且有一定差别。研究结果提示，在生产实践中采用荧光PCR 方法检测ASFV 时，一次检测的阳性和阴性结果均需谨慎评价，最终确诊需结合临床和流行病学指标，必要时可采取平行试验策略提高敏感性，或采取垂直试验策略提高特异性。

Kappa 一致性检验方法由Cohen 在1960 年首先提出，旨在评估不同方法检测结果的一致性，近年来在医学检验、流行病学及临床资料可靠性考察等方面应用较为广泛[6-8]，但在兽医实验室检测中应用极少[9]。刘华等[10-11]应用Kappa 检验法比较了猪瘟IHA 和ELISA 抗体检测方法结果的一致性，以及两种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒检测结果的一致性。但关于ASFV 荧光PCR 检测试剂盒检测结果一致性尚未见研究数据报道。依据Kappa值无法判定哪个试剂盒或方法较好，但Kappa 值越大，表明两种结果一致程度越高[6]。本研究分别计算了17 个厂家的商品化试剂盒与OIE 推荐引物探针的Kappa 值，发现12 个厂家的试剂盒与OIE推荐引物探针检测结果一致性较好，5 个厂家的试剂盒与其一致性一般，这为今后兽医实验室检测方法及试剂盒比对筛选提供了数据参考。

最低检测限研究结果表明，各厂家的试剂盒能够检测到的核酸最低浓度有所差别，且大部分国产试剂盒能够检测到的最低核酸浓度比进口试剂盒还低，提示国产试剂盒完全可以胜任ASFV 的诊断和早期发现。

本研究局限性在于样本含量相对较小，得到的敏感性、特异性95%CI 范围较大，评价的精确性还有待进一步提高。在今后的研究中，如经费充足，可提高样本含量，以便得到更为精确的敏感性和特异性等试验特性方面的数据。