食管鳞状细胞癌中CHI3L1、E-cadherin及Snail相关性研究及其意义

赵文俊 秦燕子 马莉 蔡兆根 秦永明

食管癌（Esophageal cancer, EC）的发病率在全球范围内一直位居前列，死亡率位于第六位[1]。EC在中国的发病率和死亡率一直保持在较高水平[2]，其中食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最主要的组织学类型[3]。尽管目前肿瘤的综合治疗有了很大改善，但是食管癌的侵袭、转移仍然给患者带来致命性危害。近年关于分子靶向治疗已成为研究热点，也在ESCC临床治疗中取得了较好的疗效，但是目前关于EC的发生、发展机制仍不清楚。

CHI3L1（Chitinase-3-like protein 1）又称YKL-40，位于1q32.1染色体上，编码CHI3L1蛋白，作为一种分泌型糖蛋白可分泌至细胞外进入循环系统，在炎性疾病及肿瘤中发挥重要作用[4]。在严重细菌感染[5]、炎症性肠病[6]等慢性炎症性疾病中血清CHI3L1明显升高，且其升高水平与部分疾病的严重程度呈正相关。此外，CHI3L1在多种恶性肿瘤患者血清及肿瘤细胞中高表达，且预示着肿瘤患者生存及预后不佳，提示其在肿瘤的发生与发展中发挥一定作用[7，8]。CHI3L1与ESCC发生的关系目前国内外文献报道较少，本次实验拟通过研究CHI3L1、E-cadherin与Snail的关系来探讨ESCC的发生机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2014年1～12月我院及蚌埠医学院第一附属医院ESCC存档标本164例。其中男134例，女30例；＜65岁70例，≥65岁94例；肿瘤大体形态：溃疡型70例，髓质型66例，蕈伞型18例，缩窄型10例；肿瘤位置：上段17例，中段77例，下段70例；组织学分化程度：高分化27例，中分化105例， 低分化32例；瘤体大小：＜3.5cm 83例，≥3.5cm 81例；浸润深度：侵及外膜层59例，未至外膜层105例；淋巴结转移：有61例，无103例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期114例，Ⅲ+Ⅳ期50例。收集2019年9～11月术前活检已证实为ESCC新鲜组织标本10例及其对应的癌旁标本（距癌灶5cm以上的食管上皮组织）,其中男7例，女3例；＜65岁的2例，≥65岁的8例；肿瘤大体形态:溃疡型3例，髓质型5例，蕈伞型1例，缩窄型1例；肿瘤位置:上段2例，中段7例，下段1例；组织学分化程度:高分化5例，中分化3例，低分化2例；瘤体大小:＜3.5cm 5例，≥3.5cm 5例；浸润深度:侵及外膜层6例，未至外膜层4例；发生淋巴结转移6例，未发生淋巴结转移4例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期2例。本研究得到患者同意，且术前均未行放、化疗等治疗。病理诊断结果由两位高年资病理医生共同判定。

1.2 实验方法

1.2.1 实验试剂 抗体：兔多克隆CHI3L1（ab77528，Abcam，USA）, E-cadherin（AF0131，Affinity Biosciences，USA），Snail（AF6032，Affinity Biosciences，USA），ElivisionTMplus试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新有限公司。PMSF，RIPA裂解液购自Beyotime公司， ECL化学发光试剂盒、PVDF 购自Merck Millipore公司，脱脂奶粉购自Bio-Rad公司。MMLV购自Promega公司，real- time PCR反应液配制（20μl反应体系，染料法）采用TaKaRa公司的产品，Trizol购自Invitrogen公司，RNA保护液购自TIANGEN公司。引物序列由Sangon Biotech合成。

1.2.2 Western blot实验 ESCC新鲜标本离体后剪取适量癌组织及癌旁组织分别放入EP管中，做好标记，迅速放入液氮罐中，备用。取300mg新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含PMSF的强RIPA裂解液，用电动匀浆器进行破碎匀浆，将加入裂解液后收集的样品置冰上，裂解20～30min，4℃，12 000r，离心10min，取上清，即为提取的总蛋白。按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作（Beyotime，P0010），测定样品浓度。取适量蛋白样品，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，用漩涡振荡器震荡混匀，离心，置于100℃水浴加热5min，使蛋白充分变性。把蛋白样品和预染蛋白marker直接上样到预先配制的SDS-PAGE 胶加样孔内；加入电泳液，开始电泳，转膜，将洗涤液吸去，加入Western 封闭液（5%脱脂奶粉溶液），在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。加入稀释好的一抗（CHI3L1稀释比1:1 000，E-cadherin 稀释比1:500，Snail 稀释比1:500），加稀释好的HRP标记二抗，加入TBST洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤 10min×3 次；将洗涤后的膜用滤纸吸干表面洗涤液，立刻加上配制好的ECL试剂进行化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经胶片曝光显影，扫描灰度值。重复3次实验。

1.2.3 实时荧光定量PCR 剪取适量ESCC组织及癌旁组织放入EP管中，分别倒入适量 RNA保护液，做好标记，4℃过夜，倒出RNA保护液，放入液氮罐中，备用。组织样品按50～100mg/ml Trizol加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，用电动匀浆器充分匀浆1～2min，充分裂解，实验操作参照Invitrogen公司的 Trizol 使用说明书。提取出的mRNA进行逆转录，参照 MMLV 系统使用说明书，总体积 25μl，制作 cDNA 模板。参照实时荧光定量PCR常用试剂使用说明书-染料法PCR Master Mix，加入上、下游引物，反应体系为 20μl，进行 real-time PCR 实验。95℃ 60s，60℃ 30s，95℃5s，溶解曲线分析（95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s），40个循环。重复3次实验，获得 CHI3L1，E-cadherin，Snail 及内参 GAPDH 循环 Ct 值（Ct 代表每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时的反应循环数)。引物见表1。

表1 目的基因及参照基因引物序列及产物大小

1.2.4 免疫组织化学实验方法 参照 ElivisionTMplus试剂盒说明书。切片烤干，于二甲苯溶液及梯度浓度的乙醇中脱蜡至水洗，3%过氧化氢10min 左右，抗原修复，滴一抗（CHI3L1稀释比 1:1 000，E-cadherin稀释比1:100，Snail 稀释比1:100），放入 37℃恒温箱1h，加增强剂（每块组织加1滴）后放入37℃恒温箱30min，滴二抗，DAB显色，苏木素复染1min，盐酸分析液分化，返蓝2min，中性树胶封片。采用已知阳性片作对照，以PBS 液代替一抗作空白对照。

1.2.5 结果判定 Western blot实验用目的基因的灰度值除以内参的灰度值，以校正误差，所得比值就是某样本中目的蛋白的相对表达量。实时荧光定量PCR用△△Ct法算出每个目的基因的表达值，目的基因表达值=2-(目的基因 Ct-内参基因 Ct)。免疫组化实验结果采用半定量法。肿瘤细胞染色强度：0分示不着色，1分示浅黄色，2分示棕黄色，3分示棕褐色。阳性肿瘤细胞占比：0～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为 3分，76%～100%为4分。染色强度与阳性比值相乘，＞3分为阳性，≤3分为阴性。

1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验分析 CHI3L1，E-cadherin及 Snail 与临床病理参数的关系。CHI3L1，E-cadherin及Snail相关性使用Spearman分析。单因素分析采用 Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox回归模型分析。组间比较采用t检验。Western blot及实时荧光定量 PCR实验结果用均数±标准差（±s）表示。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的表达情况CHI3L1在ESCC新鲜组织中蛋白相对表达量为0.7907±0.4490，在癌旁组织中相对表达量为0.4102±0.2647，差异具有统计学意义（t=2.308，P＜0.05）。E-cadherin蛋白在ESCC新鲜组织中相对表达量0.6060±0.1112，明显低于癌旁组织的0.8170±0.2613，差异有统计学意义（t=2.350，P＜0.05）。在ESCC新鲜组织中 Snail蛋白相对表达量为0.5213±0.2432，在癌旁组织中为0.3250±0.1266，差异具有统计学意义（t=2.261，P＜0.05）。在ESCC新鲜组织中CHI3L1 mRNA相对值为0.6504±0.5439，高于癌旁组织的0.0628±0.0955，Snail mRNA在新鲜癌组织中相对值为0.5464±0.7126。高于癌旁组织的0.0590±0.0562，差异具有统计学意义（t=3.365，P＜0.05；t=2.156，P＜0.05）。Ecadherin mRNA在ESCC新鲜组织中相对表达量为1.1990±1.4780低于癌旁组织的5.4260±2.6110，差异有统计学意义（t=4.456，P＜0.05）。CHI3L1，E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC新鲜组织与癌旁组织中的差异表达见图1、2。

图1 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的定量表达

图2 Western blot实验中CHI3L1、E-cadherin及Snail蛋白表达情况

2.2 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白表达与ESCC临床病理参数的关系CHI3L1 及Snail 阳性表达为细胞浆中呈黄色或棕黄色颗粒着色；而 E-cadherin阳性表达为细胞膜呈黄色或棕黄色着色（见图3）。肿瘤浸润至浆外膜层的CHI3L1阳性率为82.9%（87/105），未浸润至外膜层的CHI3L1阳性率为30.5%（18/59），差异具有统计学意义（P＜0.05），提示浸润深度越深，其越容易表达。发生淋巴结转移的 CHI3L1阳性率（88.5%，54/61）明显高于未发生淋巴结转移的CHI3L1阳性率（49.5%，51/103），差异具有统计学意义（P＜0.05）。pTNM 分期中Ⅰ、Ⅱ期的 CHI3L1 阳性率为52.6%（60/114），Ⅲ、Ⅳ期的 CHI3L1 阳性率为90.0%（45/50），提示肿瘤pTNM 分期越高，CHI3L1 阳性率越高（P＜0.05）。此外发现肿瘤直径越大，CHI3L1 阳性表达率越高（P＜0.05）。不同年龄、性别、肿瘤位置及组织学分化程度的患者的CHI3L1蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。淋巴结转移者的Snail阳性率明显高于未发生淋巴结转移者（P＜0.05）；肿瘤侵及浆膜层的Snail阳性率高于未侵及浆膜层的（P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤大体类型、肿瘤位置、组织学分化程度及瘤体大小的患者的Snail 阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。患者年龄越大，瘤体越大，肿瘤组织分化越低，pTNM 分期越高，发生淋巴结转移或浸润越深，E-cadherin 阳性率越低（P＜0.05）；而不同性别、肿瘤大体类型、肿瘤位置的患者的E-cadherin阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图3 CHI3L1、Snail及E-cadherin在ESCC组织中的表达

续表2

2.3 CHI3L1，E-cadherin及Snail相关性分析CHI3L1蛋白与Snail蛋白呈明显正相关（r=0.699，P＜0.05），而与E-cadherin呈负相关（r=-0.380，P＜0.05）；Snail蛋白与 E-cadherin亦呈负相关（r=-0.481，P＜0.05）。提示CHI3L1 与 Snail 具有正协同关系，而E-cadherin 与CHI3L1、Snail 具有负协同关系。见表3。

表3 ESCC中CHI3L1、E-cadherin及Snail相关性

2.4 生存分析患者5年生存率为35.9%（59/164）。Kaplan-Meier生存分析显示CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白表达与患者生存相关（Log-rank=47.964，P＜0.001；Log-rank=40.051，P＜0.001；Log-rank=75.234，P＜0.001；见图4）。CHI3L1、Snail阳性率越高，患者生存时间越短（P＜0.05）；而E-cadherin阳性率越低，患者生存时间反而越短（P＜0.05）。将患者年龄、性别、肿瘤位置、大体类型、肿瘤大小、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、pTNM分期、CHI3L1蛋白、E-cadherin蛋白及Snail蛋白纳入 Cox回归模型中，显示CHI3L1、E-cadherin 及Snail因子可以作为ESCC患者独立预后因素（P＜0.05，见表4）。

图4 CHI3L1、E-cadherin 及 Snail阳性组和阴性组中生存分析

表4 Cox回归模型多因素生存分析

续表4

3 讨论

有研究显示CHI3L1可以诱导炎性小体激活、细胞凋亡、癌变和肿瘤血管生成，参与免疫应答、炎症和细胞外基质的形成，可以调节肿瘤微环境，具有影响肿瘤生长、转移等作用[9]。本次实验中，我们证实了CHI3L1 在ESCC 中明显高表达，并随着癌组织浸润深度的加深，淋巴结发生转移及pTNM分期越晚，CHI3L1蛋白表达越高，说明高表达CHI3L1可促进 ESCC 的侵袭、转移，这与先前报道的结果一致[10，11]。有研究显示CHI3L1在乳腺癌、肾细胞癌和结直肠癌患者血清中水平显著升高，可作为判断病情和预后的标志因子[12～14]。本次实验通过Cox多因素分析显示 CHI3L1可作为评估ESCC 患者生存的独立预后因子，其高表达可能提示该患者预后不良，生存时间缩短。有研究也证实了血清CHI3L1升高与肺癌的转移和不良预后密切相关[15，16]。Zheng等[10]指出CHI3L1联合食管鳞状细胞癌抗原（Squamous cell carcinoma antigen，SCCA）可显著提高传统食管癌肿瘤标志物癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen ，CEA）、SCCA检测食管癌的敏感性。Xing等[11]首次证明了血清CHI3L1可作为食管癌预后监测指标。

E-cadherin是一种跨膜糖蛋白，属于钙黏蛋白家族之一，在正常上皮组织内位于细胞膜中，具有黏附性，介导细胞黏膜，维持上皮结构的完整性、细胞极性的作用[17]。本次实验检测了E-cadherin 在ESCC中表达降低，这与先前研究一致[18]。本次实验发现随着浸润深度加深，发生淋巴结转移，pTNM分期越晚，E-cadherin表达降低，说明 E-cadherin蛋白表达缺失或降低可能促进ESCC肿瘤细胞黏附性降低，肿瘤细胞容易发生转移、侵袭[19]。Zhai等[20]指出E-cadherin在ESCC发生淋巴结转移癌组织中表达降低，其表达与淋巴结转移呈明显负相关（P＜0.05）。国内也有研究显示E-cadherin蛋白表达随着肿瘤浸润深度的增加反而降低[21]。在本次实验中，生存分析显示E-cadherin蛋白表达越低，ESCC 患者预后越差，且 E-cadherin蛋白表达情况可以作为患者独立预后因素。

Snail是一种编码锌指结构类型的转录因子，属于锌指结合蛋白基因家族，在上皮间质转化（EMT）中发挥着重要作用[22]。Snail在多种恶性肿瘤中明显高表达，包括乳腺癌[23]、结肠癌[24]、食管癌[25]等。本次实验已证实Snail在ESCC中阳性率显著增加（P＜0.05），这与上述文献报道一致。同时，肿瘤浸润深度的增加，发生淋巴结转移，pTNM分期越高，Snail阳性率增加，提示ESCC发生侵袭与转移可能伴随着Snail的高表达。Saitoh等[26]指出Snail可诱导EMT的发生并且在促进恶性肿瘤侵袭、转移中发挥关键性作用；吴宇翔等[27]发现SIRT1可通过调控Snail表达参与食管癌细胞株EMT发生，从而促进其侵袭转移。在进行食管癌生存分析中，显示Snail阳性组生存率显著低于阴性组，Snail可以作为患者独立预后影响因素，这与先前研究一致[25，28]。

EMT可通过降低上皮标志物表达，增加间质标志物表达，使得细胞粘附能力降低而增加细胞运动能力， 从而增加肿瘤细胞的转移、侵袭能力[29]。大量研究显示钙黏蛋白E-cadherin及转录抑制因子Snail是EMT重要调控分子。在本次实验中通过Spearman相关性分析得出CHI3L1与Snail呈正相关，而与E-cadherin呈负相关，Snail与E-cadherin亦呈负相关。有文献指出CHI3L1在乳腺癌等恶性肿瘤中可通过下调 E-cadherin，从而加速肿瘤的进展；在乳腺癌上皮中通过CHI3L1过表达可以导致细胞的能动性增加，并且 E-cadherin 的表达减弱[30]。在非小细胞肺癌细胞系CL1-1、H23、H838、CL1-5 和 H2009中，CHI3L1调节EMT 标记物的表达，包括 Twist1、Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin，表明CHI3L1可通过促进肺癌细胞EMT发生从而增强肿瘤的迁移及侵袭能力[31]。复习文献及结合本次实验，我们认为在ESCC中高表达的CHI3L1与EMT发生密切相关，但是具体的机制目前还不清楚。研究显示Snail通过与E-cadherin启动子上的E-box作用元件结合，抑制E-cadherin转录，从而抑制E-cadherin表达水平，上皮间连接发生破坏，诱导EMT发生[32，33]。有报道CHI3L1可能在磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/mTOR信号通路调控中发挥作用，促使肿瘤存活、转化、侵袭和转移[34，35]。有学者认为CHI3L1是通过AKT信号通路调节EMT必需基因，从而促进癌细胞的迁移和侵袭，推测CHI3L1有可能成为癌症治疗的靶标[31，36，37]。本次实验推测高表达的CHI3L1可能与转录抑制因子Snail结合，抑制E-cadherin表达，导致细胞松散，黏附性降低，上皮逐渐向间质转化，促进ESCC细胞发生侵袭、转移。研究显示，CHI3L1在癌组织中高水平的表达与肿瘤的血管形成有关[38，39]，CHI3L1参与食管癌EMT是否也会促进血管形成，有待进一步研究及探讨。

综上所述，本次实验提示CHI3L1可能通过诱导EMT的发生参与ESCC的发生、发展。推测对CHI3L1、Snail及E-cadherin表达水平并进行干预，通过靶向分子手段下调 CHI3L1、Snail水平及增强E-cadherin水平，来达到抑制ESCC进展的目的，有望为ESCC患者靶向分子治疗提供新的途径。