腹泻型肠易激综合征小鼠模型的建立与评价

彭 颖，徐丽红，2

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹部不适或疼痛为主要特征，并伴有大便性状及排便习惯改变的功能性胃肠道疾病。临床以腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)最为常见。D-IBS的病因复杂，其发病机制尚不明确，但目前有研究认为D-IBS患者存在肠道生理和内脏敏感性改变，这一改变可能与患者肠免疫功能紊乱相关。急性束缚实验诱导的束缚应激模型是经典且广泛应用于D-IBS研究中的动物模型，但既往研究多选用SD大鼠作为模型动物，朱华 等研究表明SD大鼠的免疫活性随着月龄的增加而逐渐降低，故可能在肠道免疫学研究中存在缺陷。C57BL/6J小鼠因其细胞免疫力较少随月龄增加而降低，因此，其常用于肠道免疫学研究，但目前利用C57BL/6J小鼠进行D-IBS研究的报道较少。

为开展D-IBS肠道免疫-炎症机制相关研究，该实验预利用急性束缚应激(wrap restrain stress，WRS)构建腹泻型肠易激C57BL/6J小鼠动物模型，旨在评价WRS实验诱导的C57BL/6J小鼠D-IBS模型的可行性并监测D-IBS小鼠模型中IBS症状相关指标和肠黏膜组织病理学的改变。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

64只雌性健康C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体质量16～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK(京)，2016-0006。实验动物饲养于石河子大学医学院动物房。温度为18～25 ℃，湿度为40%，光照与黑暗时间各12 h。该实验通过石河子大学医学院第一附属医院动物实验伦理审查，批准号：A2020-165-01，将64只C57BL/6J小鼠常规饲养1周后按随机数字表法分成对照组与实验组，每组32只，共设定8个时间点，随机分组每个时间点4只小鼠。

1.2 主要仪器及试剂

BX51光学显微镜(日本奥林巴斯公司)、直径3 mm钢球(江苏嘉耐特五金公司)、邻甲苯胺-冰醋酸溶液(天津市富宇精细化工有限公司)、10%中性福尔马林溶液(北京索莱宝生物科技有限公司)、苏木精染剂(上海蓝季科技发展有限公司)、伊红染剂(天津市天新精细化工开发中心)。

1.3 D-IBS模型的制备

实验组参考文献采用WRS法建立D-IBS模型，用乙醚轻度麻醉小鼠，用纸胶带包裹束缚小鼠前肩、前上肢及胸背部以限制其梳理面部、上头和颈部,但不控制其活动。2～5 min内小鼠从乙醚麻醉中恢复，并可在笼子中自由走动，自由进食和饮水。每日束缚1次，每次束缚时间2 h，共持续14 d。

1.4 测量指标和方法

1

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4

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1

一般情况 观察小鼠皮毛色泽、精神状态、活动度及大便性状。

1

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4

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2

粪便含水量 将裁剪得当的小块滤纸放入提前预制小孔的EP管中，用千分位电子天平称量总质量，每天固定时间用滤纸刮取小鼠的新鲜粪便后装入EP管中，然后再次称量总质量，2次数值相减得到新鲜粪便质量。再将EP管置于60 ℃烘干箱中烘干24 h，称量烘干后的质量。每日测量2次，取均值作为当天粪便含水量。小鼠粪便含水量(质量%)=(新鲜粪便质量-烘干后粪便质量)/新鲜粪便质量×100%。

1

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4

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3

体质量 使用千分位电子天平称量小鼠质量(g)，精确到小数点后2位，每只连续称量3次，取均值作为当天质量。

1

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4

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4

肠道传输功能 参照参考文献的方法，在实验前将小鼠禁食24 h，吸入七氟烷麻醉，取直径3 mm的小钢球放入小鼠距肛门1～2 cm直肠内，自小鼠苏醒后计时，记录小钢球排出时间。2组小鼠分别于实验开始前1 d，实验开始后的第2周和第4周进行肠道传输功能的测定。

1

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4

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5

组织大体改变 在第2、3、4、5、6、7周末时，2组小鼠各取4只用浓度1%戊巴比妥50～60 mg/kg 腹腔注射麻醉，剖腹观察结肠外观，并测量小鼠结肠长度；再沿系膜侧剖开结肠，观察肠黏膜有无水肿、溃疡等现象。

1

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4

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6

病理组织学观察 取整段剪开的结肠后冲洗干净，用10%中性福尔马林固定24 h，切片，HE染色，行组织病理学观察。

2 结果

2.1 一般情况

2组小鼠实验开始前精神活跃，毛色黑亮，饮食、饮水量正常，排便呈椭圆形。实验开始后，D-IBS组在接受束缚刺激后，易激惹，精神低下，毛色黯淡无光泽，饮食及饮水量与对照组比较均减少，粪便稀淌，整个实验过程中，未见小鼠出现肉眼血便。对照组小鼠精神和毛色较实验开始前无明显变化，饮食及饮水量随日龄增加而增长，排便正常。

2.2 粪便含水量

计算2组小鼠每周粪便含水量的均值，在实验开始后第2周模型组粪便含水量达高峰，较同期对照组粪便含水量升高，差异有统计学意义(

t

=-12.769,

P

<0.001)，实验开始后第7周模型组粪便含水量较同期对照组粪便含水量升高，差异有统计学意义(

t

=-6.463,

P

<0.001)；实验开始后模型组小鼠粪便含水量均较实验开始前升高(

F

=44.240,

P

<0.001)。见图1A。

2.3 体质量

计算2组小鼠每周体质量的均值，实验开始后第3周模型组小鼠体质量达最低，较同期对照组小鼠体质量降低，差异有统计学意义(

t

=7.889,

P

<0.001)；而后模型组小鼠体质量缓慢上升，实验开始后第7周模型组小鼠体质量较同期对照组小鼠体质量降低，差异有统计学意义(

t

=4.112,

P

=0.006)；实验开始后1、2、3、4、5、6周模型组小鼠体质量均较实验开始前减轻(

F

=9.081,

P

<0.001)；见图1B。

2.4 肠道传输功能测定

结果显示模型组小鼠在进行束缚刺激前，小钢珠排出的时间与对照组相比差异无统计学意义(

t

=1.314 ,

P

=0.213)；在实验开始第2周(接受刺激后)排出小钢球的时间较对照组加快(

t

=-11.193 ,

P

<0.001)；在接受束缚刺激4周后(实验开始第4周)排出小钢珠的时间与对照组相比差异无统计学意义(

t

=-0.259,

P

=0.800)，见图1C。

图1 D-IBS小鼠与正常小鼠粪便含水量、体质量、肠道传输功能随时间变化趋势的对比

2.5 组织学大体改变结果

模型组小鼠和对照组小鼠剖腹均可见结肠肠壁光滑，未见充血水肿，肠道组织与周围器官无粘连。取全段结肠，模型组小鼠的结肠长度[(8.23±0.6)cm]较对照组[(8.64±0.5)cm]缩短，差异有统计学意义(

t

=2.707,

P

=0.009)。

2.6 组织病理学改变结果

光镜下观察模型组小鼠结肠表面上皮完整，腺体排列规则，未见溃疡；黏膜呈轻度慢性炎症反应，炎症主要累及黏膜固有层，炎性细胞以淋巴细胞为主；对照组小鼠结肠表面上皮完整，腺体排列规则，无溃疡；黏膜下无充血、水肿，无炎性细胞浸润。见图2。

图2 模型组与对照组远端结肠组织病理学改变 HE染色

3 讨论

根据罗马Ⅳ诊断标准将IBS分为D-IBS、便秘型(constipation-predominant IBS,C-IBS)、混合型(mixed-type IBS，M-IBS)以及不定型(unsubtyped IBS,U-IBS)4种类型，其中D-IBS是IBS的主要亚型，占IBS病例的23.3%～65.0%，且患病率呈逐年上升趋势。但到目前为止，D-IBS的发病机制仍未阐明。现有研究认为，其发生发展可能与心理压力、中枢过度紧张、神经内分泌异常、胃肠道蠕动紊乱、黏膜免疫激活、肠屏障功能障碍、内脏超敏性、肠道菌群改变和遗传易感性等因素相关，近年来，越来越多的研究表明D-IBS肠道黏膜存在持续的低度炎症，推测其发生发展可能启动了免疫-炎症机制，但具体机制不详，需进一步探讨。

现有的D-IBS动物模型的制备方法主要包括应激、结直肠球囊扩张、化学药物诱导、基因敲除和寄生虫感染等，这些方法所制备的模型各有其特征和独特作用，其中应激导致的D-IBS模型因其较其他几种模型操作简便、时间短、重复性好、经济实用且最符合RomeIII标准提出的生物-社会-心理医学模式而广泛应用。应激模型包括急性应激模型、慢性应激模型、急-慢性应激模型和母婴分离模型等，其中慢性应激模型和急-慢性应激模型造模方法成本高且需要投入大量的精力；母婴分离模型虽然制作简单，但有文献指出造模结束后模型动物成年后并未出现肠道动力改变,也没有排便习惯改变及大便性状异常，故该模型具有一定局限性；WRS模型制作方法简单、模型稳定性高、模型制备时间短，能使模型小鼠产生胃肠功能亢进、内脏敏感性增高以及精神活动失调的病理表现，能较好的模拟人类D-IBS症状，且不造成模型动物肠道溃疡形成，因此，其在D-IBS的研究中被广泛应用。故该实验选用WRS实验作为动物模型制备方法。

目前，在关于D-IBS的相关研究中，大多研究选择的动物模型为SD大鼠，但有文献指出SD大鼠的免疫活性随着月龄的增加而逐渐降低，故可能不适用于肠道免疫学的研究，且有研究表明模型大鼠虽出现了粪便含水量增加，体质量减轻，肠道传输功能增加等类似人类D-IBS的症状，但其模型大鼠肠道黏膜出现了黏膜表面轻度糜烂，这与人类的D-IBS表现存在不同；而C57BL/6J小鼠因其免疫系统相对稳定，其免疫系统活性较少因月龄的增加而降低，故适宜用于肠道免疫学的相关研究。该研究预选择以C57BL/6J小鼠作为模型动物。

人类D-IBS的主要症状以腹痛、腹部不适、腹泻为主，D-IBS患者结肠黏膜上皮层及固有层淋巴细胞计数明显高于健康人群。该实验选用WRS实验诱导的C57BL/6J小鼠D-IBS模型，实验开始后模型组小鼠粪便含水量均较实验开始前升高(

F

=44.240,

P

<0.001)，且均高于同期对照组小鼠粪便含水量(均

P

<0.05)；实验开始后1、2、3、4、5、6周模型组小鼠体质量均较实验开始前减轻(

F

=9.081,

P

<0.001)，且均低于同期对照组小鼠体质量(均

P

<0.05)；模型组小鼠在实验开始第2周(接受束缚刺激后)排出小钢球的时间较对照组加快(

t

=-11.193 ,

P

<0.001)；肠黏膜组织大体观察，模型小鼠结肠肠壁光滑，无充血水肿，肠道组织与周围器官无粘连，未见明显器质性病变；模型组小鼠结肠长度虽较对照组缩短，但与对照组小鼠相差不大，推测可能和小鼠体质量偏低、体型偏小有关；显微镜下病理组织学观察，表面上皮完整，腺体排列规则，无脓肿、溃疡，炎症主要累及黏膜固有层，炎性细胞以淋巴细胞为主。该实验结果提示，模型小鼠粪便含水量增加，肠道传输功能亢进，体质量减轻，肠黏膜无溃疡形成，且存在显微镜下慢性炎性改变，与人类D-IBS的临床症状和病理组织学改变极为相似，故可认为该实验模型制备成功。