人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究

冯 阳，贺 凡，涂珍珍，臧丹丹，倪鸣岳，周海胜,

G蛋白偶联受体107(G protein-coupled receptor 107，GPR107)是G蛋白偶联受体超家族成员，因尚未找到其天然配体，属于孤儿受体。人类GPR107的cDNA最先从肺组织中获得克隆。GPR107蛋白结构分析显示其N-末端存在疏水的信号肽和7个跨膜区，这是G蛋白偶联受体超家族成员的典型特征。GPR107在系统发育上高度保守，有研究表明GPR107与网格蛋白和逆转录蛋白VPS35结合，并且可能负责受体从内细胞室返回质膜，GPR107可能是与G蛋白结合以调节细胞内囊泡运输的受体之一。

为了过量表达GPR107蛋白并确定其亚细胞定位，利用分子克隆技术构建质粒pCMV-Tag2B-GPR107，将其转染至人胚肾上皮细胞(HEK 293T)，通过Western blot、激光共聚焦等方法，观察转染前后GPR107在体内的表达变化及其亚细胞分布，为进一步研究GPR107的功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

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细胞系与载体 人胚胎肾细胞系293T细胞在该实验室保存；真核细胞表达载体pCMV-Tag-2B购自美国Promega公司；克隆载体pMD-18T购自大连宝生物有限公司；自人cDNA文库中获得GPR107 cDNA的质粒(克隆号：23329)由厦门大学韩家淮教授惠赠。

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引物 根据韩家淮教授实验室提供人GPR107基因的mRNA序列，利用Primer-BLAST在线软件进行引物设计。根据真核表达载体pCMV-Tag 2B多克隆位点的限制性核酸内切酶，在上游和下游引物的5′端分别引入限制性核酸内切酶BamH I和Hind III的识别序列及其保护碱基。使用的引物序列为：上游引物P1，5′-CGCGGATCCGCGATGGCCGCTCTGGCGC-3′(红色表示BamH I识别位点)；下游引物P2，5′-CCCAAGCTTGGGCACGGCGCCTTCCCAC-3′(红色表示Hind Ⅲ识别位点)。引物由上海生物工程有限公司合成。

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主要试剂 DMEM高糖培养基、青霉素和链霉素双抗混合液、磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自美国Corning公司；Taq酶、PCR试剂盒、DNA Marker均购自日本TaKaRa公司；转染试剂I′mafect购自北京Imagen公司；鼠源抗GPR107和兔源抗GAPDH抗体均购自安徽朵能生物科技有限公司；兔源抗Flag抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 方法

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载体构建 按1∶150扩增含GPR107 cDNA的质粒菌液，培养过夜后提取质粒。以提取的质粒DNA为模板，采用PCR方法扩增GPR107 cDNA。PCR的条件是：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、100 s，72 ℃、5 min，共35个循环。琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA，切胶回收目的片段，与pMD18-T Vector连接构建重组克隆载体，利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ消化pCMV-Tag 2B载体和重组的克隆载体，切胶回收目的DNA，用T4 DNA连接酶连接GPR107目的片段和pCMV-Tag 2B载体，然后转化到感受态细胞中，平板克隆后挑取菌落扩大培养，PCR鉴定，提取质粒，经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切后，选取酶切鉴定条带位置一致的克隆，送上海生物工程股份有限公司测序。

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细胞培养 人胚胎肾细胞系293T使用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖培养基，于5% CO、37 ℃恒温培养箱中培养。

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重组质粒pCMV-Tag2B-GPR107瞬时转染细胞 293T细胞以1×10接种于60 mm培养皿，待其贴壁后长至70%～80%密度后进行转染，转染前1 h，更换新鲜的完全培养基，置37 ℃、5% CO培养，同时配置转染工作液，脂质体与DNA的比例为1∶1.5，即将4 μl I′mafect转染试剂稀释至100 μl不含血清的培养液中轻轻混匀、6 μg DNA稀释至100 μl不含血清的培养液中轻轻混匀，室温放置5 min后，将I′mafect稀释液逐滴加入DNA稀释液中，轻轻混匀后室温放置20 min，将200 μl转染工作液逐滴加入293T培养液中，6 h后更换含10% FBS的高糖DMEM，培养48 h后收取蛋白。

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Western blot实验 转染48 h后，收集细胞总蛋白。制备10%的SDS-PAGE凝胶，上样后80 V恒压待浓缩胶平齐后，120 V恒压至最底端，恒流200 mA、90 min转膜，4 ℃封闭5 h，4 ℃过夜孵育一抗GPR107(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)。次日TBST洗涤3次,每次10 min，4 ℃ HRP标记的二抗孵育3 h，TBST洗涤3次后，ECL发光试剂反应，凝胶成像系统采集图像，最后用Image J软件对目的条带进行灰度分析。

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激光共聚焦实验 先将pCMV-Tag2B-GPR107瞬时转染细胞至293T细胞，待24 h后取20%左右已经转染的细胞铺至玻底培养皿，待细胞贴壁，24 h后，弃培养基，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton X-100透化剂透化，加入3%马血清封闭1 h，一抗(兔源抗Flag)4 ℃孵育过夜，使用带荧光标记Alexa Flour 647的二抗4 ℃孵育2 h，室温染核10 min，激光共聚焦显微镜观察、拍片。

2 结果

2.1 pCMV-Tag2B-GPR107载体构建结果

利用人cDNA文库中获得的GPR107 cDNA质粒为模板，通过PCR获得人GPR107 cDNA(图1A)，GPR107目的片段长度为1 659 bp，连接到克隆载体pMD18-T Vector上并将其菌液进行PCR鉴定。PCR结果显示，提取的10个克隆中有7个克隆为阳性重组载体(图1B)。将2号克隆进行扩增、提取质粒DNA、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得与目的片段大小一致的DNA(图1C)。将此目的DNA亚克隆到带有Flag标签的pCMV-Tag2B载体并进行PCR鉴定，筛选出4个阳性的重组表达载体(图1D)，选取2号克隆进行DNA测序，将测序结果与原cDNA序列进行比对，实验表明目的基因无突变且表达框无误以及pCMV-Tag2B-GPR107载体构建成功。

图1 pCMV-Tag2B-GPR107载体构建

2.2 重组质粒pCMV-Tag2B-GPR107转染293T细胞后蛋白表达量变化

为了在细胞水平检测GPR107的表达量变化，将pCMV-Tag2B-GPR107重组质粒转染至293T细胞，48 h后提取蛋白，结果显示：未转染组GPR107蛋白相对表达量为0.28，Flag蛋白相对表达量为0.31，转染组GPR107蛋白相对表达量为0.59，Flag蛋白相对表达量为0.81，故与未转染组比较，转染了pCMV-Tag2B-GPR107的实验组GPR107的蛋白量明显上调(

F

=28.408，

P

=0.033)；同样转染组Flag蛋白量也明显上调(

F

=87.433，

P

=0.011)(图2)。

图2 Western blot检测GPR107在293T细胞中的表达量

2.3 激光共聚焦显微镜实验结果

为了检测GPR107在细胞内的定位情况，将pCMV-Tag2B-GPR107转染293T细胞，于激光共聚焦显微镜下观察GPR107细胞内的分布情况，图3结果显示GPR107主要分布在细胞质中。

图3 GPR107在293T细胞中的定位 ×640

3 讨论

GPR107是最早从哺乳动物肺中克隆到的cDNA，属于一个新的编码蛋白家族的成员。人类GPR107基因位于9q34.11的常染色体区域，基因全长86.4 kb，包含18个外显子。其蛋白质结构分析提示疏水信号肽序列位于氨基末端、一个较长的胞外结构域和7个跨膜结构域(LUSTR结构域)，这7次跨膜结构域与GPCRs相似，位于羧基末端。而在每个LUSTR亚家族中，第3个细胞内环高度保守，通常在其他GPCR的第3个细胞内环结构域参与G蛋白结合和受体信号传递，表明LUSTR蛋白的这一区域也参与G蛋白偶联的信号转导过程。因此，确定GPR107在细胞中的分布，为证实GPR107羧基末端对其细胞定位及转运过程中的作用奠定基础。

为了确定GPR107蛋白在细胞内分布，该研究构建了人GPR107的真核表达载体，在转染293T细胞后获取总蛋白进行Western blot分析，结果显示GPR107在人293T细胞中成功过量表达。GPR107是具有7个跨膜的蛋白，既往研究表明GPR107的主要功能可能是与G蛋白结合以调节细胞内囊泡运输。而富含囊泡的亚细胞器结构主要是分布于细胞质中的内质网和高尔基体，免疫荧光共定位结果显示GPR107在细胞内表达主要在细胞质中，而在细胞核中未见GPR107的表达，这与文献报道的GPR107定位于高尔基体与核质有差异，可能与GPR107表达的细胞种类有关。

既往研究表明，GPR107可能是一种神经生长抑素的候选受体，通过与神经生长抑素相互作用，在心血管功能的中枢调控中发挥重要作用，而且GPR107在胰腺组织中具有较高的表达水平。研究表明，在小鼠和人胰腺细胞上GPR107和神经生长抑素可以发生共定位，可能参与胰腺分泌进而影响消化系统的功能。此外，有报道GPR107在肝癌和前列腺癌组织中具有较高表达水平，提示GPR107可能与肿瘤的发生发展密切相关。故GPR107在293T细胞中的过表达或许也是与肿瘤有关，具体机制有待进一步研究。

GPR107在高等真核生物中普遍的表达和保守模式使得GPR107可能属于在高尔基体中协调G蛋白依赖事件的GPCRs。通过成功构建人GPR107的真核表达载体，研究表明能在293T细胞中过量表达，并主要分布在细胞质中，为后续研究其作用机制奠定基础。同时，需要对GPR107在不同细胞中表达定位的差异性与GPR107的功能及其作用机制进行更深入研究。