长非编码RNA-SNHG4促进胃癌细胞增殖生长并介导对化疗药物顺铂耐药性的研究

韩 涵，喻 鑫，周 波, 张宗耀，张培培，刘 弋

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内具有很高的致死率。胃癌的主要治疗方法是手术切除和化疗，但晚期胃癌患者的平均生存期不到1年。关于胃癌发生发展、增殖转移相关机制的探索一直是科学家们致力的方向，但是目前针对胃癌可用的治疗靶标仍然很少，进一步的研究迫切而必要。顺铂是当前治疗胃癌的重要化疗药物之一，顺铂耐药阻碍着它的应用。该课题探索了长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)-SNHG4在胃癌细胞增殖和顺铂耐药中的作用，同时明确SNHG4在胃癌患者组织中的表达及其病理学意义。

该课题在胃癌细胞MKN-45和AGS中，构建SNHG4稳转细胞系，通过细胞功能实验(包括MTT实验和3-D细胞培养实验)证明SNHG4对胃癌增殖生长和顺铂耐药的作用；临床患者组织学分析证明SNHG4的临床病理学意义。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

该课题选取胃癌细胞MKN-45和AGS作为实验对象，两种细胞均来自ATCC细胞库(american type culture collection, ATCC)。细胞培养条件是37 ℃，5% CO。

1.2 稳定转染细胞系构建

该实验将SNHG4 DNA全长序列克隆进pSin载体上，进一步构建慢病毒载体并建立稳定转染胃癌细胞系MKN-45 SNHG4和AGS SNHG4，相应对照细胞命名为MKN-45 Vec和AGS Vec。实验方法参照先前文章的报道，病毒转导48 h后，用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞。

1.3 逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

该题通过逆转录-实时荧光定量PCR实验检测lncRNA-SNHG4的表达水平，实验方法参照先前的报道。GAPDH作为内参。实验中用到的引物包括：SNHG上游引物：5′-GCAGGTGACAGTCTGCATGT-3′，下游引物：5′-TTTTAAGTCCCCTACCCCCATC-3′；GAPDH上游引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′,下游引物：5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′。

1.4 MTT实验

该课题通过MTT实验检测细胞活力，实验操作参照先前文章的报道，胃癌稳转细胞系及其对照细胞MKN-45 SNHG4/MKN-45 Vec、AGS SNHG4/AGS Vec种于96孔细胞培养板中，每孔种植细胞数为5 000个，每种细胞平行重复3孔，24 h后细胞培养基换成含0、3、6、12 μg/ml浓度顺铂的培养基，48 h后进行MTT实验，检测OD570吸光度。

1.5 3-D细胞培养实验

该课题通过3-D细胞培养实验检测细胞的增殖和生长能力。具体实验步骤包括：24孔细胞培养板中每孔加入200 μl下层基质胶，4 ℃冰箱中过夜铺平，用普通培养基配制8%浓度的基质胶，同时准备单细胞悬液，调整细胞浓度，单细胞悬液与8%基质胶1∶1混合，基质胶终浓度为4%，每孔种植细胞4 000个，培养基体积是500 μl，每种细胞平行重复3孔，每3 d更换1次细胞培养基(含4%基质胶)，该实验在细胞种植后48 h更换含0.6 μg/ml顺铂的培养基处理细胞48 h，3-D细胞培养在第8天进行拍照检测并定量分析。

1.6 临床组织标本

该课题组收集2018—2019年在安徽医科大学第一附属医院行手术治疗的患者的临床组织标本，包括胃癌组织和癌旁组织各60例，同时获取了胃癌患者对应的临床病理学特征参数，包括年龄、性别、肿瘤体积大小、有无淋巴结转移、病理学分级和临床分期。胃癌患者组织的使用征得了患者的知情许可。

1.7 统计学处理

采用SPSS 16.0 软件进行分析。该课题实验均独立重复3 次，结果取平均值。实时荧光定量PCR、MTT和3-D细胞培养实验统计学分析均采用

t

检验。SNHG4在组织中的表达分析以及临床病理特征相关性分析均采用χ检验。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG4对胃癌细胞MKN-45的增殖生长能力并介导顺铂耐药影响

该实验中通过慢病毒载体构建了胃癌细胞MKN-45过表达lncRNA-SNHG4的细胞系，命名为MKN-45 SNHG4，相应对照细胞命名为MKN-45 Vec。实时荧光定量PCR实验表明，对比MKN-45 Vec细胞，MKN-45 SNHG4中的SNHG4水平提高(图1A)。图1B显示，MTT实验表明过表达SNHG4的MKN-45细胞，其细胞活力升高；在分别加入3、6、12 μg/ml顺铂后，MKN-45 SNHG4和MKN-45 Vec细胞的细胞活力均下降，但是与MKN-45 Vec细胞相比，MKN-45 SNHG4细胞活力下降的程度降低。3-D细胞培养实验同样显示，MKN-45 SNHG4细胞的生长能力高于MKN-45 Vec细胞；在加入6 μg/ml顺铂后，两种细胞的生长能力均受到抑制，但与MKN-45 Vec细胞相比，MKN-45 SNHG4细胞生长能力受到的抑制较小[比例变化分别为：-/+(顺铂)MKN-45 Vec细胞2.68(

P

<0.05), MKN-45 SNHG4细胞1.84(

P

<0.05)](图1C)。因此，实验表明SNHG4促进胃癌细胞MKN-45的增殖生长能力，并促进细胞对顺铂的耐药。

图1 SNHG4对胃癌细胞MKN-45的增殖生长能力并介导顺铂耐药的影响

2.2 SNHG4对胃癌细胞AGS的增殖生长能力并介导顺铂耐药的影响

与MKN-45细胞相似，该实验构建了胃癌细胞AGS的稳转细胞系AGS SNHG4和AGS Vec。与对照细胞比较，AGS SNHG4细胞的SNHG4表达水平升高(实时荧光定量PCR)(图2A)；同时AGS SNHG4细胞的细胞活力增加；3、6、12 μg/ml顺铂抑制AGS SNHG4和AGS Vec细胞的细胞活力，但是与AGS Vec细胞相比，AGS SNHG4细胞活力下降的程度降低(图2B)。3-D细胞培养实验同样显示，AGS SNHG4细胞的生长能力高于AGS Vec细胞；在加入6 μg/ml顺铂后，两种细胞的生长能力均受到抑制，但是与AGS Vec细胞相比，AGS SNHG4细胞生长能力受到的抑制较小[比例变化分别为：-/+(顺铂)MKN-45 Vec细胞2.83(

P

<0.05), MKN-45 SNHG4细胞1.81(

P

<0.05)](图2C)。因此，实验表明SNHG4促进胃癌细胞AGS的增殖生长能力，并促进细胞对顺铂的耐药。

图2 SNHG4对胃癌细胞AGS的增殖生长能力并介导顺铂耐药的影响

2.3 胃癌组织中SNHG4的表达分析及其病理学意义

该实验收集了60例胃癌组织标本和60例癌旁胃组织标本，通过实时荧光定量PCR实验检测了SNHG4的表达水平，随机选取3例癌旁胃组织标本的SNHG4表达水平取均值，小于或等于该均值的0.85倍定义为SNHG4低表达，大于该均值的0.85倍定义为SNHG4高表达。如表1所示，在癌旁组织中28例(总共检测60例)SNHG4高表达，所占比例为46.7%；在胃癌组织中，42例(总共检测60例)SNHG4高表达，所占比例为70.0%。因此，SNHG4在胃癌组织中相对于癌旁组织表达水平升高(

P

=0.01)。同时，该课题组收集了胃癌组织标本对应胃癌患者的病理学特征参数，进一步通过卡方检验进行统计学分析。如表2所示，SNHG4在胃癌组织中的高表达与患者的肿瘤体积大小、淋巴结转移和病理学分级具有相关性，

P

值分别是0.006、0.009和0.031。但是，SNHG4在胃癌组织中的表达水平与患者的年龄、性别和肿瘤临床分期无相关性。

表1 SNHG4在胃癌和癌旁组织中的表达[n(%)]

表2 SNHG4表达水平与胃癌患者临床病理特征相关性分析[n(%)]

3 讨论

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内具有很高的致死率。尽管目前早期胃癌的发现率有所提高，但多数患者在发现时已是中晚期胃癌。针对中晚期胃癌，治疗手段有限，目前仍然是以手术治疗和化学药物治疗为主，可用于胃癌的分子靶向治疗药物仍然十分有限。当前针对胃癌发生发展、转移侵袭等机制的探索仍然是研究的热点与难点。近些年，科学家们又揭示了许多非编码RNA在胃癌的发生发展中发挥重要作用，比如Qin et al报道了lncRNA-MDC1-AS通过MDC1依赖的信号通路在胃癌细胞中发挥抑制增殖和转移的作用；Jin et al报道了微小RNA(microRNA)-582-5p通过靶向调节AKT3基因抑制胃癌细胞的增殖；Li et al报道了环状RNA-0000096在胃癌细胞中发挥促癌作用。该课题表明lncRNA-SNHG4在胃癌细胞中发挥促癌功能。顺铂是治疗胃癌的常用化疗药物，顺铂耐药阻碍了顺铂在胃癌患者中的应用，在先前的报道中，许多机制揭示了胃癌顺铂耐药的原因，其中包括：环状RNA-AKT3促进PIK3R1表达、抑制miR-198的作用从而在胃癌细胞中发挥促进顺铂耐药的功能；HOXD-AS1调节PDCD4和EZH2，从而在胃癌细胞中促进顺铂耐药；微小RNA-Let-7b通过靶向调节AURKB基因抑制胃癌细胞生长和顺铂耐药。因此，胃癌细胞的顺铂耐药机制比较复杂，更进一步的研究是必要而有意义的。该研究揭示了lncRNA-SNHG4在胃癌细胞中具有促进顺铂耐药的作用。

lncRNA是一种重要的非编码RNA，在人类几乎所有的生理过程中发挥着重要作用。近年来，许多文献揭示了lncRNAs在人类肿瘤中起着关键的肿瘤促进因子或抑癌因子作用。该课题中研究表明lncRNA-SNHG4能够促进胃癌细胞的增殖生长并介导化疗药物顺铂的耐药。在先前的研究中，SNHG4被报道通过吸附miR-449c-5p和上调脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的STAT6来减轻炎症反应；SNHG4通过吸附miR-377-3p作用促进骨肉瘤的增殖和转移；SNHG4通过吸附miR-377-3p和调控miR-138/c-Met信号通路促进神经母细胞瘤增殖、迁移和侵袭；SNHG4通过靶向miR-148a-3p调节c-Met促进宫颈癌的进展；SNHG4通过调节miR-98-5p促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭性和上皮-间充质转化；SNHG4在前列腺癌中也发挥促癌作用。但是SNHG4在胃癌中的作用仍然研究甚少，该课题研究表明SNHG4在胃癌细胞中促进细胞的增殖生长，并介导化疗药物顺铂的耐药性，该结论与SNHG4在其他癌种中的功能是一致的，因此，SNHG4在人体多种恶性肿瘤中具有广泛的促癌作用。

该课题通过MTT检测细胞活力实验和3-D细胞培养实验表明了lncRNA-SNHG4在胃癌细胞中的促癌功能和促进顺铂耐药的作用，受限于研究条件，该研究没有进一步揭示出SNHG4的下游分子机制，这也是该研究的缺陷，该课题组将在后续工作中继续进行深入探索。据先前的研究报道，SNHG4靶向吸附miRNA，包括了miR-449c-5p、miR-377-3p、miR-138、miR-148a、miR-98-5p等，进一步通过miRNA靶向抑制靶基因(包括c-Met、ZIC5等)的表达介导其促癌功能，其中包括了骨肉瘤、神经母细胞瘤、宫颈癌、肺癌和前列腺癌等，但胃癌中尚未见报道。在胃癌细胞中，SNHG4很可能也是通过靶向吸附这些miRNA，从而调节下游靶基因，这些基因也很可能在胃癌细胞中介导了胃癌细胞增殖和药物耐药的功能。

该研究收集了临床胃癌组织标本和癌旁正常胃组织标本各60例，检测SNHG4的表达水平并作临床病理学特征相关性分析，结果显示SNHG4在胃癌组织中的表达高于正常组织，在胃癌患者中SNHG4的高表达与患者的肿瘤体积大小、淋巴结转移和病理学分级具有相关性。