长链非编码RNA DGUOK-AS1对肺鳞癌增殖及凋亡的影响

曹艳红，王保龙

在中国，肺癌是相当常见的恶性肿瘤，其发生率和病死率均很高。非小细胞肺癌大约占肺癌类型的85%，而肺鳞癌又是非小细胞肺癌的主要病理类型，且与肺腺癌相比，肺鳞癌发病机制的研究和治疗明显滞后。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)属于一组没有蛋白质编码能力的转录本，全长200多个核苷酸,具有保守的二级结构，可与蛋白质、DNA和RNA相互作用，通过多种机制在多种层面调控基因的表达。已有文献报道，lncRNA参与人类多种癌症的发生和发展，与细胞周期、信号转导以及细胞凋亡等途径密切相关。通过TCGA数据库筛选，与正常组织相比，lncRNA DGUOK-AS1在肿瘤组织中表达量异常升高,采用RNA干扰技术下调lncRNA DGUOK-AS1的表达，研究DGUOK-AS1对肺鳞癌增殖和凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

肺鳞癌NCI-H520 和SK-MES-1细胞株均购自上海生命科学研究院；胎牛血清(PN血清和BI血清)、DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基以及0.25%细胞胰酶消化液均购自合肥飒英斯生物科技有限公司；TRIzol试剂和Lipofectamine 2000均购自美国 Invitrogen公司；DGUOK-AS1引物、siRNA及阴性对照siRNA-NC均购自合肥通用生物公司；荧光定量PCR检测试剂盒购自日本Takara公司；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁公司；Annexin V/PI法细胞凋亡检测试剂盒购自德国Biolegend公司；PCNA、Bcl2、Bax、cyclin D1、c-myc和β-cantenin抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；RNA质核分离试剂盒购自美国 Invitrogen公司。

1.2 方法

1

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2

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1

细胞培养 在37 ℃、5% CO的培养条件下，用RPMI 1640培养基培养NCI-H520细胞，用DMEM高糖培养基培养SK-MES-1细胞，当培养皿内细胞的融合度约90%时，则进行细胞传代及后续相关实验。

1.2.2

细胞瞬时转染 细胞传代时，将NCI-H520和SK-MES-1细胞接种于6孔板，第2天待细胞密度约40%～60%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明进行实验操作，将DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分别转染于NCI-H520和SK-MES-1两种肺鳞癌细胞中。

1

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2

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3

qRT-PCR检测DGUOK-AS1的表达 利用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA,使用Takara逆转录试剂和qRT-PCR定量试剂盒检测DGUOK-AS1的表达，以GAPDH作为内参，计算DGUOK-AS1的相对表达量。

1

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2

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4

CCK-8检测细胞增殖 将DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分别转染于NCI-H520和SK-MES-1细胞，48 h后，胰蛋白酶进行消化，分别接种于96孔板中，平行设置5个复孔，置于37 ℃、5% CO温箱中培养，分别检测0、24、48、72 和96 h细胞的增殖情况。每孔加入10 μl的CCK-8试剂,温箱温育2 h后，利用自动酶标仪测定双波长450、630 nm处的吸光度值。

1

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2

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5

细胞凋亡检测 将DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分别转染于NCI-H520和SK-MES-1细胞，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，采用Annexin v FITC/PI双染，通过流式细胞仪对干扰组和对照组的细胞凋亡情况进行检测并分析细胞凋亡率的变化。

1

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2

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6

Western blot检测相关蛋白的表达变化 将DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分别转染于NCI-H520和SK-MES-1细胞，48 h后提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。然后进行SDS-PAGE电泳，再将其转到PVDF膜上，接下来用10%的脱脂牛奶封闭，再分别加入相对应的一抗，4 ℃孵育过夜。用TBST溶液洗膜3次后，加入配好的二抗，室温孵育1 h，即可进行曝光，检测蛋白的表达情况。

1

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2

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7

RNA质核分离验证DGUOK-AS1的亚细胞定位 收集NCI-H520和SK-MES-1细胞，严格按照试剂盒操作说明，提取细胞总RNA、细胞质RNA以及细胞核RNA, 接下来使用Takara逆转录试剂和qRT-PCR定量试剂盒分别检测DGUOK-AS1的表达，以GAPDH作为细胞质内参，U6作为细胞核内参。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0 软件进行数据分析，以上实验均重复3次，两组独立样本之间均值的比较，采用的统计学推断方法为

t

检验，样本统计量

t

值用SPSS软件进行数据分析，当

P

<0.05时，被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DGUOK-AS1在肺鳞癌组织和细胞系中均呈高表达

首先通过TCGA 数据库进行筛选，结果显示肺鳞癌组织中lncRNA DGUOK-AS1高表达(

P

<0.05)。见图1A。随后在细胞系中进行验证，qRT-PCR结果显示，肺鳞癌细胞系NCI-H520和SK-MES-1中DGUOK-AS1的表达水平高于正常肺上皮细胞(BEAS-2B)(NCI-H520:

t

=153.2,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=121.8,

P

<0.001)。见图1B。因此，选取lncRNA DGUOK-AS1作为后续的研究对象。

图1 LncRNA DGUOK-AS1的差异表达

2.2 干扰DGUOK-AS1对肺鳞癌细胞增殖的影响

为了进一步探究DGUOK-AS1在肺鳞癌发生发展中所发挥的作用，首先利用siRNA技术干扰DGUOK-AS1的表达，用qRT-PCR分别检测NCI-H520和SK-MES-1细胞干扰组和对照组中DGUOK-AS1的表达，与对照组相比，干扰组DGUOK-AS1的表达水平下降，且差异有统计学意义(NCI-H520：

t

=55.47,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=25.2,

P

<0.001)。见图2A。随后，用CCK-8试剂检测干扰DGUOK-AS1对细胞增殖的影响，结果显示干扰组的细胞增殖能力降低(

P

<0.01)。见图2B、C。随后，检测增殖细胞核抗原PCNA蛋白表达的变化,结果显示干扰组PCNA表达下降。见图2D、E。以上实验结果提示，当DGUOK-AS1表达量降低时，肺鳞癌细胞的增殖可能受到抑制。

图2 干扰DGUOK-AS1对NCI-H520和SK-MES-1细胞增殖的影响

2.3 干扰DGUOK-AS1对肺鳞癌细胞凋亡的影响

首先利用siRNA技术降低DGUOK-AS1的表达，流式细胞术检测DGUOK-AS1干扰组和对照组细胞的凋亡情况，结果显示与对照组相比，降低DGUOK-AS1的表达可使肺鳞癌细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(NCI-H520:

t

=37.3,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=58.48,

P

<0.01)，见图3A～D。Western blot结果显示，肺鳞癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl2表达降低，而促凋亡蛋白Bax表达升高，从而促进肺鳞癌细胞的凋亡，见图3E、F。以上结果显示，干扰 DGUOK-AS1可促进肺鳞癌细胞的凋亡。

图3 干扰DGUOK-AS1对NCI-H520和SK-MES-1细胞凋亡的影响

2.4 干扰DGUOK-AS1对Wnt/β-Cantenin信号通路相关蛋白表达的影响

为了检测 DGUOK-AS1是否可以通过Wnt/β-catenin通路影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，利用Western blot检测Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白：β-catenin、c-myc及cyclin D1蛋白的表达。结果显示，相对于对照组，β-catenin、c-myc及cyclin D1蛋白在DGUOK-AS1干扰组的表达降低(NCI-H520:

t

=22.25,

P

<0.001;

t

=28.15,

P

<0.001;

t

=38.17,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=34.64,

P

<0.001;

t

=60.47,

P

<0.001;

t

=15.12,

P

<0.01)，见图4A～D。以上数据表明，下调DGUOK-AS1的表达可能通过抑制 Wnt/β-cantenin信号通路，从而影响肺鳞癌细胞的增殖及凋亡。

图4 干扰DGUOK-AS1对Wnt/β-Cantenin信号通路相关蛋白表达的影响

2.5 lncRNA DGUOK-AS1在细胞中的主要定位

为了深入探究DGUOK-AS1可能的作用机制，首先对DGUOK-AS1的亚细胞定位进行验证，利用lncLocator数据库对DGUOK-AS1的定位进行预测，预测结果提示DGUOK-AS1可能主要定位于细胞质。见表1。随后在肺鳞癌NCI-H520和SK-MES-1细胞中进行验证，以GAPDH作为质内参，U6作为核内参，RNA质核分离结果显示DGUOK-AS1主要位于细胞质(图5A、B)，这提示DGUOK-AS1可能发挥CeRNAs的作用来调节下游基因，从而进一步影响肺鳞癌的发生发展。

图5 lncRNA DGUOK-AS1在NCI-H520和SK-MES-1细胞中的主要定位

表1 lncLocator 数据库对DGUOK-AS1定位预测

3 讨论

肺鳞癌是比较常见的非小细胞肺癌的病理类型，在全世界每年约有40多万人死于肺鳞癌，且其发病常与吸烟密切相关。由于肺鳞癌缺乏可以作为药物靶点的致瘤突变，晚期肺鳞癌的标准治疗以化疗为主，因此，至今鲜有较好的靶向治疗手段。近年来，随着高通量测序、基因芯片等技术的兴起，研究表明在多种类型的肿瘤中，lncRNA的异常表达对寻找有效的肿瘤治疗靶点具有重要的参考意义。lncRNA调控肿瘤的作用机制主要有2种：转录水平调控和转录后水平调控。前者在细胞核内通过与核内因子作用发挥调控作用；后者可以在细胞质中竞争内源RNAs(CeRNAs)，在肿瘤的发生发展过程中发挥非常重要的调控作用。相关文献报道，LncRNA RHPN1-AS1可以通过抑制细胞迁移和增殖在头颈部鳞状细胞癌中发挥负调控作用,LncRNA ZEB1-AS1可以通过在宫颈癌中上调ZEB1的表达，参与细胞侵袭和上皮向间充质转化(EMT)。另外也有研究报道，LncRNA LINC01089可作为临床预后的标志，并通过调节Wnt/β-cantenin信号通路抑制乳腺癌细胞生长，lncRNA PCAT6也通过Wnt/β-cantenin信号通路影响细胞增殖和迁移，同时也是宫颈癌的预后指标。

目前与肺鳞癌相关的lncRNA的研究尚未深入，lncRNA在肺鳞癌发生、发展中的功能及机制亟待进一步探索。对于LncRNA DGUOK-AS1的研究较少，仅有少数文献报道其在宫颈癌中高表达，影响宫颈癌的发生发展，但在其他肿瘤中尚未报道。在该研究中，TCGA数据库显示DGUOK-AS1在肺鳞癌组织中高表达，同时细胞学实验证实DGUOK-AS1在肺鳞癌细胞系中也呈现高表达。DGUOK-AS1的干扰抑制肺鳞癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，这决定了DGUOK-AS1在肺鳞癌中起癌基因的作用。此外，降低DGUOK-AS1的表达，Western blot 结果显示Wnt/β-cantenin 信号通路相关蛋白：β-cantenin、c-myc及cyclin D1蛋白表达降低，表明DGUOK-AS1可能通过激活Wnt/β-cantenin 信号通路，进而影响肺鳞癌细胞的增殖及凋亡。

文献中证实位于细胞质中DGUOK-AS1可与miR-653-5p结合影响其靶基因EMSY的表达，从而影响宫颈癌细胞的增殖。该研究表明肺鳞癌细胞中DGUOK-AS1也主要定位于细胞质，提示这可能通过发挥CeRNAs的作用影响肺鳞癌细胞的增殖与凋亡。该研究后续将通过多个数据库预测及筛选肺鳞癌细胞中DGUOK-AS1所靶向的miRNA,并利用双荧光素酶报告实验进行验证，进一步探究DGUOK-AS1影响肺鳞癌发生发展的内在分子机制。

综上所述，该研究初步表明lncRNA DGUOK-AS1可以促进肺鳞癌细胞增殖，抑制肺鳞癌细胞的凋亡，可能为肺鳞癌患者治疗策略的探索提供新的思路。